J.P. Euzéby : Dictionnaire de Bactériologie Vétérinaire

En 1942, Waksman a défini les antibiotiques comme des substances chimiques, produites par des micro-organismes et capables, à faible concentration, d'inhiber la croissance d'autres micro-organismes ou même de les détruire. Cette définition classique, permettant de différencier les antibiotiques des substances de synthèse dotées d'un pouvoir antibactérien, ne semble plus justifiée car de nombreuses substances, autrefois obtenues à partir de culture, sont actuellement synthétisées ou modifiées par synthèse.
En bactériologie médicale, on préfère donc retenir une définition plus large : les antibiotiques sont des composés chimiques, élaborés par un micro-organisme ou produit par synthèse et dont l'activité spécifique se manifeste à dose faible sur les micro-organismes.

Les antibiotiques utilisables en thérapeutique sont très nombreux et ils sont regroupés en familles selon leur structure chimique (tableau I).

Chaque antibiotique est caractérisé par son spectre d'activité qui correspond aux différentes espèces bactériennes susceptibles d'être sensibles à son action. Selon les antibiotiques le spectre est limité ou large.
Exemples :
. La pénicilline G ou les macrolides ont un spectre limité aux bactéries à Gram positif et aux coques à Gram négatif.
. La colistine a un spectre étroit limité aux bacilles à Gram négatif à l'exception des Proteus sp., des Providencia sp., des Serratia sp. ou des Bacteroides sp.
. Le métronidazole a un spectre d'activité très particulier car son action s'exerce uniquement sur les bactéries anaérobies sauf les bacilles anaérobies à Gram positif non sporulés.
. Les aminosides ou aminoglycosides ont un spectre large même si les bactéries anaérobies sont résistantes.
. Les tétracyclines, les phénicolés et les sulfamides ont un spectre large et sont actifs sur les bacilles et les coques, à Gram positif ou à Gram négatif, aérobies ou anaérobies ou aéro-anaérobies. Enterococcus faecalis et les lactobacilles sont toutefois résistants aux sulfamides.

Le corollaire du spectre d'activité est la résistance naturelle des bactéries aux antibiotiques. Ainsi, les entérobactéries qui sont des bacilles à Gram négatif sont naturellement résistantes à la pénicilline G. La résistance naturelle est un caractère d'espèce, elle touche toutes les souches d'un espèce bactérienne donnée.
La résistance naturelle des principales espèces bactériennes d'intérêt médicale est donnée dans les Recommandations du Comité de l'Antibiogramme (CA-SFM).

La connaissance du spectre d'activité des antibiotiques (et donc de la résistance naturelle des bactéries) devrait permettre d'instaurer un traitement. Dans la réalité, la situation est beaucoup plus complexe car les bactéries peuvent acquérir une résistance aux antibiotiques par modification de leur capital génétique (mutation, acquisition de plasmides, acquisition de transposons). Cette résistance acquise préexiste à l'utilisation des antibiotiques mais l'utilisation intensive de ces molécules conduit à une sélection de nombreuses souches résistantes. Aussi, dans de nombreux cas, la seule identification de l'espèce bactérienne ne permet plus de prédire l'efficacité d'une antibiothérapie.

La notion de résistance est relative et, en pathologie infectieuse, on dit qu'une souche bactérienne est résistante à un antibiotique lorsqu'une modification de son capital génétique lui permet de tolérer une concentration d'antibiotique notablement plus élevée que la concentration qu'il est possible d'obtenir in vivo à la suite d'un traitement.
Par exemple, les souches de Escherichia coli sont normalement sensibles à des concentrations d'amoxicilline inférieures à 4 mg/L. Au sein de cette sous-espèce, certaines souches ont acquis la capacité de résister à des concentrations d'amoxicilline supérieures à 16 mg/L. De telles souches sont dites résistantes car, à la suite d'un traitement, les concentrations maximales sériques et tissulaires d'amoxicilline ne dépassent pas 16 mg/L.

Dans le traitement d'une maladie bactérienne, il faut sélectionner l'antibiotique le plus efficace sur la bactérie pathogène et s'assurer que les concentrations atteignent un taux thérapeutique au sein du foyer infectieux. Le rôle du laboratoire de bactériologie est d'isoler et d'identifier les bactéries puis de déterminer in vitro, à l'aide de méthodes rigoureusement standardisées, l'activité des divers agents antimicrobiens.

Antibiogramme

Principe

L'antibiogramme a pour but de déterminer la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) d'une souche bactérienne vis-à-vis des divers antibiotiques. Par définition (O.M.S.), la CMI est la plus faible concentration d'antibiotique capable de provoquer une inhibition complète de la croissance d'une bactérie donnée, appréciable à l'œil nu, après une période d'incubation donnée. La détermination de cette valeur est peu précise mais elle est consacrée par l'usage et elle bénéficie d'une masse importante d'informations recueillies à son sujet.

Techniques classiques

Méthodes de dilution

Les méthodes de dilution sont effectuées en milieu liquide ou en milieu solide. Elles consistent à mettre un inoculum bactérien standardisé au contact de concentrations croissantes d'antibiotiques selon une progression géométrique de raison 2.

En milieu liquide (figure 1), l'inoculum bactérien est distribué dans une série de tubes (méthode de macrodilution) ou de cupules (méthode de microdilution) contenant l'antibiotique. Après incubation, la CMI est indiquée par le tube ou la cupule qui contient la plus faible concentration d'antibiotique et où aucune croissance n'est visible.

En milieu solide (figure 1), l'antibiotique est incorporé dans un milieu gélosé coulé en boîtes de Pétri. La surface de la gélose est ensemencée avec un inoculum des souches à étudier (un inoculateur à têtes multiples, appareil de Steers, permet d'ensemencer de 20 à 30 souches différentes par boîte). Après incubation, la CMI de chaque souche est déterminée par l'inhibition de la croissance sur le milieu contenant la plus faible concentration d'antibiotique.
La méthode de dilution en milieu gélosé, réalisée avec une gamme de concentrations en progression géométrique de raison 2 (ou de raison 1,25), est la méthode de référence.

Les techniques de dilution en milieu gélosé permettent également de mesurer la concentration inhibitrice 99 p. cent (concentration qui inhibe la croissance de 99 p. cent des cellules d'une souche bactérienne) ou la concentration inhibitrice 50 p. cent (concentration qui inhibe la croissance de 50 p. cent des cellules d'une souche bactérienne). Les déterminations des concentrations inhibitrices 99 p. cent et 50 p. cent sont plus précises que la détermination des CMI puisque les écarts-types moyens sont respectivement de 0,3 log base 2 et de 0,07 log base 2 contre 0,7 log base 2 pour la CMI.

Dans la pratique courante, les méthodes de dilution sont de mise en œuvre délicate et/ou onéreuses et elles sont réservées à des laboratoires spécialisés.

Méthodes de diffusion : antibiogramme standard

Les méthodes de diffusion ou antibiogrammes standards sont les plus utilisées par les laboratoires de diagnostic.

Des disques de papier buvard, imprégnés des antibiotiques à tester, sont déposés à la surface d'un milieu gélosé, préalablement ensemencé avec une culture pure de la souche à étudier. Dès l'application des disques, les antibiotiques diffusent de manière uniforme si bien que leurs concentrations sont inversement proportionnelles à la distance du disque. Après incubation, les disques s'entourent de zones d'inhibition circulaires correspondant à une absence de culture. Lorsque la technique est parfaitement standardisée, les diamètres des zones d'inhibition dépendent uniquement de la sensibilité du germe.

A la limite des zones d'inhibition, il existe dans la gélose des concentrations d'antibiotiques égales aux CMI. Les méthodes de diffusion ne permettent pas de chiffrer directement ces valeurs. Toutefois, il existe une relation simple entre les diamètres des zones d'inhibition et les log₂ des CMI mesurées par les techniques de dilution. Ces relations, appelées droites de concordance ou droites de régression (figure 2), ont été établies par des laboratoires spécialisés travaillant dans des conditions standardisées. A condition de respecter un protocole identique, ces courbes sont utilisables par un laboratoire de diagnostic. En théorie, les mesures des diamètres des zones d'inhibition et leurs reports sur les courbes de concordance donnent les valeurs des CMI en mg/L. Dans la pratique, les résultats de la technique des disques doivent être considérés comme uniquement qualitatifs en raison de la variabilité expérimentale des diamètres et de l'erreur sur les valeurs de la pente et de l'ordonnée à l'origine des droites de régression (Guérin-Faublée et Carret).

Standardisation

La fiabilité des résultats d'un antibiogramme est influencée par de nombreux paramètres qui doivent être rigoureusement contrôlés. La standardisation est régie par des documents émanant de l'O.M.S. et des divers comités nationaux (pour la France, le Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie et, pour la bactériologie animale, le Comité Français d'Accréditation). Selon les pays, il peut exister des variations techniques et il est important de respecter une technique identique à celle utilisée pour l'établissement des courbes de concordance.

Parmi les principales recommandations, on peut citer les points suivants :

. Le milieu de culture doit permettre la croissance de nombreuses bactéries et il ne doit pas contenir d'inhibiteurs des antibiotiques. Le milieu retenu pour la majorité des espèces bactériennes est celui de Mueller-Hinton.
La gélose de Mueller-Hinton est enrichie de 5 p. cent de sang de mouton pour les streptocoques, de 5 p. cent de sang de mouton ou de cheval pour les campylobactéries, de 10 p. cent de cheval pour Helicobacter pylori ou de 5 p. cent de sang de cheval hémolysé pour l'étude de la sensibilité des streptocoques vis-à-vis d'une association sulfamide-triméthoprime.
Pour Haemophilus influenzae et Neisseria gonorrhoeae (germes dépourvus d'intérêt en médecine vétérinaire), le milieu de Mueller-Hinton est remplacé par une gélose chocolat PolyVitex® et pour les bactéries anaérobies par une gélose Wilkins Chalgren additionnée de 5 p. cent de sang de mouton (ou une gélose Brucella contenant 1 mg/L de vitamine K1 et 5 p. cent de sang).
Dans le cas particulier de la recherche de la résistance à la méticilline de Staphylococcus aureus subsp. aureus, il est possible d'utiliser un milieu de Mueller-Hinton hypersalé (Cf. infra).

. Les teneurs en calcium et en magnésium doivent être contrôlées car des concentrations trop élevées inhibent l'action des aminosides (réduction de la fixation sur la membrane externe de certaines bactéries à Gram négatif), des tétracyclines (chélation) et des polymyxines.

. La teneur en thymidine doit être fixe car elle nuit à l'activité des sulfamides.

. Le pH influence l'activité de plusieurs antibiotiques (les aminosides et les macrolides sont plus actifs en milieu alcalin alors que les tétracyclines sont plus actives en milieu acide) et il doit être compris entre 7,2 et 7,4 (valeur qui permet une bonne croissance bactérienne et qui réalise un compromis pour l'activité des antibiotiques).

. Pour les méthodes de diffusion, la source d'antibiotique est en fait constituée par le disque et le cylindre de gélose sous-jacente. L'épaisseur de la gélose va donc conditionner la concentration de la source d'antibiotique et elle doit être de 4 mm.

. Les antibiotiques ainsi que les disques doivent être standardisés. Cette standardisation est effectuée par les fabriquants et le laboratoire a pour unique responsabilité de stocker les disques dans des conditions optimales et de ne pas utiliser des disques périmés. Avant utilisation, les disques doivent être amenés à température ambiante. Toute cartouche ouverte doit être utilisée dans les cinq jours.

. La densité de l'inoculum bactérien est un élément primordial et elle doit être ajustée à l'aide d'un photomètre ou par comparaison avec un étalon d'opacité (échelle de McFarland).
En France, l'antibiogramme par diffusion est réalisé avec une suspension contenant environ 10⁶ bactéries par mL (ensemencement par inondation) ou 10⁷ bactéries par mL (ensemencement par écouvillonage). Pour certaines bactéries, l'inoculum doit être plus important : 10⁷ bactéries par mL (ensemencement par inondation) ou 10⁸ bactéries par mL (ensemencement par écouvillonage)pour les streptocoques ou les campylobactéries, 10⁸ pour les bactéries anaérobies et 10⁹ pour Helicobacter pylori.
Pour les méthodes de dilution en milieu gélosé, les spots doivent renfermer environ 10⁴ bactéries et ce nombre est porté à 10⁵ pour les campylobactéries ou pour les bactéries anaérobies et à 10⁶ pour Neisseria gonorrhoeae.

. Une phase de pré-diffusion des antibiotiques peut conduire à l'obtention de zones d'inhibition plus importantes. Selon les pays, une pré-diffusion est ou non préconisée. En France, la technique du "Comité de l'Antibiogramme de la SFM" ne prévoit pas de pré-diffusion. En revanche, la technique du "Swedish Reference Group for Antibiotics (SRGA) and its subcommittee on methodology (SRGA-M)" impose une phase de pré-diffusion.

. La température et la durée d'incubation doivent être fixes. Pour la majorité des bactéries l'incubation est effectuée à 35-37 °C durant 18-24 heures dans une atmosphère normale.
Pour Neisseria meningitidis et Neisseria gonorrhoeae, l'incubation est réalisée dans une atmosphère contenant 5 p. cent de dioxyde de carbone.
Pour les Campylobacter sp. l'incubation est effectuée en micro-aérophilie ou en anaérobiose.
La durée de l'incubation, effectuée dans une atmosphère dépourvue d'oxygène, est portée à 48 heures pour les bactéries anaérobies et à 72 heures (dans une atmosphère micro-aérophile) pour Helicobacter pylori.
Dans le cas particulier de la recherche de la résistance à la méticilline de Staphylococcus aureus subsp. aureus, il est possible d'utiliser soit une gélose de Mueller-Hinton hypersalée (2 à 4 p. cent) et incubée à 37 °C soit une gélose de Mueller-Hinton incubée à 30 °C. L'incubation peut éventuellement être prolongée jusqu'à 48 heures si la croissance est faible.

. La technique doit être régulièrement contrôlée avec des souches de référence. Les souches recommandées par le Comité de l'Antibiogramme de la SFM sont les suivantes : la souche ATCC 25922 (= CIP 76.24 = DSM 1103 = NCIB 12210 = JCM 5491) de Escherichia coli, la souche ATCC 27853 ( = CIP 76.110 = DSM 1117 = LMG 6395) de Pseudomonas aeruginosa, la souche ATCC 25923 (= CIP 76.25 = DSM 1104 = JCM 2413 = NCTC 12981) de Staphylococcus aureus subsp. aureus, la souche CIP 107808 de Providencia stuartii et la souche CIP 104485 (= CNRP 16000) de Streptococcus pneumoniae.

La mise en place d'un contrôle de qualité interne a fait l'objet de recommandations de la part du Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (voir Recommandations du Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie) :
Lors de sa première mise en œuvre par un laboratoire, la technique de diffusion doit être réalisée quotidiennement 8 à 10 jours de suite afin de la maîtriser, avec les souches de référence et les antibiotiques suivants : pénicilline G, oxacilline, amoxicilline, amoxicilline/acide clavulanique, ticarcilline, pipéracilline, céfalotine, céfotaxime, ceftazidime, imipénème, gentamicine, tobramycine, amikacine, acide nalidixique, péfloxacine, ciprofloxacine, triméthoprime/sulfaméthoxazole, érythromycine, lincomycine, pristinamycine, rifampicine, acide fusidique, fosfomycine, colistine, vancomycine et teicoplanine.
Le maintien de la qualité est ensuite vérifié au minimum une fois par mois. Si des résultats corrects ne sont pas obtenus, des mesures correctives sont mises en place, impliquant alors de revenir à la première étape du contrôle de qualité.

Le besoin d'une harmonisation européenne dans la méthodologie des tests a conduit, en 2002, à la création de l'EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptbility Testing). Le Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie prend une part active à l'EUCAST et elle est l'un des six comités nationaux reconnus par l'EUCAST.

Résultats

Expression des résultats (figure 3)

Les résultats quantitatifs (CMI en mg/L) sont le plus souvent interprétés par les laboratoires en terme de possibilité thérapeutique. Elle consiste à comparer les valeurs des CMI avec les concentrations critiques établies pour chaque antibiotique.
Pour certaines espèces (Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori), pour certains genres (Acinetobacter, Streptococcus, Enterococcus, Staphylococcus, Campylobacter), pour la famille des Enterobacteriaceae et pour les bactéries anaérobies, des concentrations critiques particulières ont été établies.

Schématiquement, la concentration critique supérieure correspond à la plus grande quantité d'antibiotique actif que l'on peut obtenir dans le sérum et les tissus à la suite d'un traitement effectué à la posologie habituelle et la concentration critique inférieure correspond à la plus faible concentration humorale et tissulaire d'antibiotique actif.

En réalité, les critères permettant d'établir les valeurs des concentrations critiques sont multiples :
. Critères bactériologiques basés sur les distributions des CMI des populations bactériennes des différentes espèces et possédant ou non des caractères de résistance acquise biochimiquement et génétiquement identifiés.
. Critères pharmacocinétiques observés avec les posologies normales et maximales et selon les différentes voies d'administration. Les études pharmacocinétiques doivent apporter des informations sur l'absorption, la distribution, la biotransformation et l'élimination des antibiotiques.
. Critères cliniques permettant de moduler les données pharmacologiques. Un individu infecté par une bactérie dont les CMI sont connues est-il ou non guéri par un traitement qui semblait bien adapté compte tenu des résultats obtenus in vitro ? Bien que l'accumulation des observations soit très lente, "les données reliant les CMI aux résultats thérapeutiques ont largement contribué à la validité de l'antibiogramme" (Sirot).
. Critères techniques tenant à la reproductibilité des résultats.

La prise en compte de ces différents critères permet de dresser un tableau des concentrations critiques pour les principaux antibiotiques. Selon le poids attribué à tel ou tel critère, il est normal d'observer des variations d'opinion aussi, il n'existe pas d'accord au plan international et l'O.M.S. confie l'établissement des tableaux des concentrations critiques aux autorités nationales. En France, ce tableau est établi, chaque année, par le Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie.
L'un des buts de l'EUCAST (Cf. supra) est d'établir des concentrations critiques acceptables par l'ensemble des pays européens.

L'établissement d'un tel tableau permet une catégorisation clinique.
. Si, pour un antibiotique donné, la CMI d'une souche est inférieure à la concentration critique inférieure, la souche est qualifiée de sensible.
. Si la CMI d'une souche est supérieure à la concentration critique supérieure, la souche est qualifiée de résistante.
. Si la CMI est comprise entre les deux concentrations critiques, la souche est dite de sensibilité intermédiaire.

La confrontation des CMI aux concentrations critiques permet donc aux laboratoires de donner les résultats sous la forme de bactérie sensible, intermédiaire ou résistante à un antibiotique. Selon le Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (voir Recommandations du Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie) les définitions de bactérie sensible, intermédiaire ou résistante sont les suivantes :

. Une souche sensible est une souche pour laquelle la probabilité de succès thérapeutique est forte dans le cas d'un traitement par voie systémique avec la posologie recommandée dans le résumé des caractéristiques du produit (RCP).

. Une souche de sensibilité intermédiaire est une souche pour laquelle le succès thérapeutique est imprévisible. Ces souches forment un ensemble hétérogène pour lequel les résultats obtenus in vitro ne sont pas prédictifs d'un succès thérapeutique. En effet, ces souches :
- peuvent présenter un mécanisme de résistance dont l'expression in vitro est faible, avec pour conséquence leur classement dans la catégorie sensible. Cependant, in vivo, une partie de ces souches apparaît résistante au traitement ;
- peuvent présenter un mécanisme de résistance dont l'expression n'est pas suffisante pour justifier un classement dans la catégorie résistante, mais suffisamment faible pour espérer un effet thérapeutique dans certaines conditions (fortes concentrations locales ou posologies accrues).
La catégorie intermédiaire est aussi une zone tampon qui tient compte des incertitudes techniques et biologiques.

. Une souche résistante est une souche pour laquelle il existe une forte probabilité d'échec thérapeutique quels que soient le type de traitement et la dose d'antibiotique utilisée.

Lecture interprétative de l'antibiogramme

La lecture interprétative de l'antibiogramme est fondée sur la connaissance des phénotypes de résistance. Elle a pour principal but de transformer un résultat catégorisé "sensible" en un résultat "intermédiaire" ou "résistant" en raison d'un risque d'échec thérapeutique. De plus, pour quelques couples bactérie antibiotique, malgré une catégorisation " sensible ", le risque accru de sélection in vivo de mutants résistants justifie un commentaire particulier destiné au clinicien. La lecture interprétative nécessite une identification correcte de la souche et une méthode d'antibiogramme parfaitement standardisée. La mise en évidence de phénoypes de résistance hautement improbables compte tenu de l'identification de la souche doit conduire à vérifier l'identification bactérienne, à contrôler la pureté de l'inoculum et à contrôler la technique de l'antibiogramme.
Quelques exemples de lecture interprétative sont donnés dans le tableau II. Des renseignements complémentaires figurent dans les Recommandations du Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie.

Généralisation des résultats à des antibiotiques non testés

Le choix des antibiotiques testés repose avant tout sur l'identification du germe et sur la connaissance de sa résistance naturelle. Ce choix dépend également du site de l'infection et de l'espèce animale infectée.

Parmi les antibiotiques susceptibles d'être utilisés en thérapeutique, toutes les molécules ne sont pas prises en compte. En effet, la connaissance des familles d'antibiotiques et des mécanismes de résistance croisée permet de ne faire figurer dans l'antibiogramme qu'un nombre restreint de molécules représentatives. Quelques exemples de généralisation des résultats à des molécules non testées sont donnés dans le tableau II. Des renseignements complémentaires figurent dans les Recommandations du Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie.

Autres techniques

Techniques en milieu liquide

La détermination de la sensibilité peut se réaliser en milieu liquide en testant la sensibilité de la souche bactérienne vis-à-vis des concentrations critiques supérieures et inférieures des différents antibiotiques ou uniquement vis-à-vis des concentrations critiques inférieures. Ces méthodes simplifiées sont commercialisées, par exemple "ATB Antibiogramme" (bioMérieux) ou "ATB VET" (bioMérieux) (figure 4), ce qui les rend accessibles aux laboratoires de diagnostic. L'inoculation des galeries et la lecture des résultats peuvent se réaliser manuellement ou à l'aide d'automates.

Technique en milieu gélosé : le Etest®

La détermination précise de la CMI par la méthode de référence est difficilement utilisable en pratique quotidienne. La commercialisation d'une technique rapide et simple, le Etest (AB Biodisk), permet à un laboratoire de diagnostic de mesurer la CMI (figure 5).

Le Etest permet de déterminer la CMI grâce à l'utilisation de bandelettes imprégnées d'un gradient exponentiel continu de l'antibiotique à tester. Ce gradient couvre une zone qui, en fonction des molécules, va de 0,016 à 256 mg/L ou de 0,002 à 32 mg/L. Le Etest associe les caractéristiques des méthodes de diffusion et de dilution en milieu solide. Les bandelettes (supports inertes, hydrophobes, de 5 mm de largeur et de 50 mm de longueur) sont appliquées sur la surface d'un milieu gélosé préalablement ensemencé avec un inoculum de la souche à étudier. Après incubation, l'inhibition de la croissance se traduit par une ellipse d'inhibition dont les points d'intersection avec la bandelette définissent la CMI. Une échelle de lecture, imprimé sur la bandelette, permet une interprétation rapide.

Le milieu de culture (Mueller-Hinton ou milieux plus adaptés pour les bactéries à croissance lente et pour les anaérobies) est ensemencé soit par inondation soit par écouvillonnage (technique de Kirby-Bauer). La technique de Kirby-Bauer est conseillée pour les bactéries à croissance lente et pour les anaérobies. L'inoculum doit être standardisé et les boîtes doivent être parfaitement séchées avant le dépôt des bandelettes. Ce dépôt est un temps délicat, il est impératif de ne pas déplacer les bandelettes sur la surface de la gélose car l'antibiotique diffuse dans le milieu en quelques secondes.

Lorsque la zone d'inhibition est nette et parfaitement symétrique, la lecture ne pose aucun problème. Dans tous les autres cas, une interprétation est nécessaire : une zone de décrochage (dip) dans la zone de lecture impose de lire la CMI en extrapolant la courbe de l'ellipse ; la présence de colonies "squatter" doit être analysée (résistance hétérogène, émergence de mutants résistants, mélange bactérien) ; la présence d'une croissance en ligne le long de la bandelette n'est pas prise en compte et résulte certainement d'un séchage insuffisant de la surface du milieu ; une asymétrie des points d'intersection de l'ellipse avec la bandelette conduit à lire la CMI au niveau le plus élevé.

Limites de l'antibiogramme

Limites techniques

La réalisation d'un antibiogramme est soumise au respect de conditions techniques qui sont parfois incomplètement et insuffisamment respectées.

Un antibiogramme doit obligatoirement être effectué sur une culture pure et identifiée. Cette dernière condition permet d'ajuster la densité de l'inoculum, de choisir judicieusement les antibiotiques à tester et de pratiquer une lecture interprétative.
Un antibiogramme réalisé de manière non standardisée et sur un mélange de germes non identifiés est dépourvu de sens. Pourtant, des kits destinés aux vétérinaires praticiens, ont été (et sont encore ?) commercialisés. Ces kits sont sensés permettre de faire rapidement un choix raisonné (sic) de traitement antibiotique directement (!!!) à partir de l'échantillon et sans isolement préalable (!!!).

Tout laboratoire devrait vérifier la validité de sa technique en testant, au moins une fois par mois, la sensibilité des souches de référence et vérifier que les diamètres des zones d'inhibition obtenues vis-à-vis des divers antibiotiques sont conformes aux valeurs publiées par le Comité de l'Antibiogramme.

Les techniques de l'antibiogramme ont été standardisées uniquement pour les bactéries cultivant rapidement sur milieux usuels. Lorsque la souche isolée ne rentre pas dans ce cadre, l'interprétation est parfois délicate :
. Les bactéries appartenant aux genres Haemophilus, Brucella, Pasteurella, Campylobacter, Nocardia... requièrent l'emploi de milieux et de conditions de culture adaptés à leurs exigences de croissance. D'une manière générale, on considère que la résistance est sans ambiguïté mais que la sensibilité n'est qu'apparente et devrait être confirmée par des techniques de dilution.
En médecine vétérinaire, des bactéries cultivant mal dans les conditions de l'antibiogramme standard sont fréquemment isolées. C'est le cas des représentant de la famille des Pasteurellaceae ou de Arcanobacterium pyogenes.
Le National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), comité américain de standardisation, a créé un sous-comité vétérinaire. Ce sous-comité préconise de tester les pasteurelles par la méthode standard et de ne pas tester la sensibilité aux antibiotiques des souches de Arcanobacterium pyogenes qui sont généralement sensibles à la pénicilline G. Pour Histophilus somni et Actinobacillus pleuropneumoniae, le sous-comité vétérinaire du NCCLS a défini des protocoles particuliers.
. En raison de la petite taille des colonies et de la durée d'incubation souvent longue, la méthode de diffusion en milieu gélosé est inadaptée pour les mycoplasmes.
. Les espèces des genres Chlamydia, Chlamydophila, Rickettsia... sont des parasites intracellulaires obligatoires et l'étude de leur sensibilité aux antibiotiques nécessite le recours à des techniques particulières rarement effectuées en routine.
. L'antibiogramme ne permet pas de déterminer la sensibilité des mycobactéries à croissance lente et pour les espèces à croissance rapide on doit avoir recours à des méthodes de dilution.
. Les techniques de diffusion appliquées aux anaérobies ont été critiquées car elles ne peuvent être appliquées ni à toutes les espèces ni à tous les antibiotiques. Elles sont peu reproductibles et les résultats diffèrent souvent de ceux obtenus par dilution. Ces techniques sont cependant utilisées pour détecter des résistances inhabituelles : résistance au métronidazole ou aux associations bêta-lactamines - inhibiteurs des bêta-lactamases chez Bacteroides fragilis ; résistance à la pénicilline chez les clostridies.
. Les antibiotiques réservés à un usage vétérinaire ne sont pas pris en compte par les standards classiques. Toutefois, à compter de 2006, le "Groupe de travail : antibiogramme vétérinaire du Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie" publie les concentrations critiques et les diamètres critiques pour certains antibiotiques réservés à l'usage vétérinaire (Cf. infra).

La technique des disques s'applique mal à l'évaluation de la sensibilité à des molécules qui diffusent peu dans la gélose ce qui est le cas des polymyxines ou des glycopeptides et toute résistance devrait être confirmée par la mesure de la CMI.

Limites dans l'interprétation des résultats

Comparaison CMI / concentrations critiques

Durant de nombreuses années, les valeurs des concentrations critiques n'avaient été établies que chez l'homme et les bactériologistes vétérinaires confrontaient les résultats des CMI à des chiffres certainement erronés pour les animaux.

Pour remédier à cette situation, le Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie a créé un groupe de travail vétérinaire. Ce groupe a défini une liste des concentrations et diamètres critiques par espèce bactérienne. La liste des antibiotiques se limite aux molécules autorisées en médecine vétérinaire et pour lesquelles des disques sont disponibles en France. Le quatrième communiqué du groupe de travail vétérinaire est disponible sur Internet (voir Communiqué du Groupe de travail : Antibiogramme Vétérinaire). Ce communiqué présente les concentrations critiques, les diamètres critiques et les règles de lecture interprétative pour les souches vétérinaires appartenant aux familles des Enterobacteriaceae et des Pasteurellaceae et pour les souches des genres Staphylococcus et Streptococcus.
Le document du "Groupe de Travail Vétérinaire du Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie" a l'avantage d'indiquer les CMI pour quelques antibiotiques réservés à un usage vétérinaire tels que le ceftiofur, la cefquinome, la tilmicosine, le florfénicol, la danofloxacine, la difloxacine, l'enrofloxacine ou la marbofloxacine.
Malheureusement, les listes établies ne concernent que quelques taxons d'intérêt vétérinaire et elles ne font pas de distinction entre les espèces animales. Ainsi, l'interprétation de la sensibilité d'une souche d'Escherichia coli sera la même alors qu'elle peut avoir été isolée d'espèces très différentes telles que les volailles, les porcs, les bovins, les ovins, les caprins, les carnivores ...
Comme c'est le cas pour "le groupe de travail humain", le document établi par le "groupe de travail vétérinaire" ne précise pas la liste des taxons inclus dans les familles ou genres retenus. Comme il n'existe pas de classification officielle des bactéries (voir le fichier ¤ Introduction à la taxonomie des procaryotes), il peut exister un doute pour quelques espèces ou genres bactériens. Ainsi, le genre Plesiomonas doit-il être considéré comme un représentant de la famille des Enterobactericaeae ou comme un représentant de la famille des Aeromonadaceae ou des Vibrionaceae ?

Incertitude sur l'étiologie de l'infection

"Le clinicien en possession d'un résultat (...) mentionnant le nom d'une bactérie qui lui est familière et l'antibiogramme correspondant, a fréquemment du mal à concevoir que ce résultat peut être sans intérêt, même nocif. Le choix erroné de la bactérie responsable de l'infection constitue l'une des causes les plus fréquentes de discordance observée entre les résultats in vitro et in vivo." (Goldstein).

En effet, l'antibiogramme ne peut apporter une aide que dans la mesure où il est effectué sur la bactérie véritablement responsable de l'infection. Parmi les bactéries isolées d'un prélèvement, le laboratoire doit faire un choix et n'effectuer l'antibiogramme que sur l'espèce ou les espèces susceptibles de jouer un rôle étiologique. Ce choix n'est possible que dans la mesure où le bactériologiste possède des connaissances en pathologie infectieuse vétérinaire et dans la mesure où il dispose d'une fiche de commémoratifs détaillée.

Évaluation de l'intensité d'action d'un antibiotique

L'antibiogramme ne renseigne que sur l'activité bactériostatique. L'étude du pouvoir bactéricide d'un antibiotique sur la souche isolée nécessite d'autres tests (Cf. infra) rarement effectués en pathologie animale. Toutefois, si l'état de santé de l'animal nécessite le recours à un agent bactéricide, le vétérinaire peut choisir, parmi les antibiotiques actifs, une des molécules ayant généralement un effet bactéricide (bêta-lactamines, aminosides, polymyxines, quinolones de 2ème génération...).

Association d'antibiotiques

D'une manière générale, l'antibiogramme ne permet pas la mise en évidence des interactions éventuelles entre deux agents antimicrobiens et l'étude des synergies ou antagonismes nécessite des tests complémentaires (Cf. infra). En l'absence de tests complémentaires, le respect des lois de Jawetz (tableau III) peut permettre d'éviter les erreurs les plus grossières.

Il existe toutefois deux cas particuliers où l'antibiogramme est apte à donner des indications sur les associations :
. La résistance aux macrolides, lincosamides et streptogramines (résistance MLS), par synthèse d'une méthylase inductible, peut être détectée en plaçant un disque d'érythromycine en regard d'un disque de lincomycine. L'érythromycine déclenche la synthèse de la méthylase inductible et une image d'antagonisme est visible en face du disque de lincomycine.
. Un disque unique est utilisé pour les associations bêta-lactamine-inhibiteurs des bêta-lactamases ou pour les associations triméthoprime-sulfamides.

Cas particulier des streptocoques et des entérocoques

La détermination de la sensibilité des streptocoques et des entérocoques aux aminosides permet au clinicien de prédire l'effet d'une association aminoside-bêta-lactamine.
Les streptocoques et les entérocoques sont naturellement résistants à de faibles concentrations d'aminosides car ces antibiotiques pénètrent difficilement dans le cytoplasme. L'association avec une bêta-lactamine qui altère la biosynthèse de la paroi facilite la pénétration. Cette association est cependant inefficace si la souche de streptocoques ou d'entérocoques a acquis une résistance aux aminosides par mutation ou par synthèse d'enzymes altérant l'antibiotique. Ce haut niveau de résistance est détecté en utilisant des disques fortement chargés en streptomycine, en gentamicine ou en kanamycine.

En pratique, la réponse streptocoque ou entérocoque résistant à un aminoside signifie que son association avec une bêta-lactamine n'est pas souhaitable. Inversement, la réponse sensible signifie que l'aminoside pourra être utilisé mais uniquement en association avec une bêta-lactamine et à condition que la souche soit sensible aux bêta-lactamines.

Une interprétation plus fine des divers résultats est donnée dans le tableau II.

Absence de parallélisme entre les situations in vitro et in vivo

L'antibiogramme ne peut prédire le comportement d'un antibiotique in vivo. Celui-ci est fonction de multiples facteurs :
. choix d'un schéma posologique ;
. diffusion au site de l'infection ;
. pénétration dans les cellules ce qui est important à considérer pour les infections dues aux bactéries intracellulaires (les antibiotiques pénétrant bien dans les cellules sont les tétracyclines, le chloramphénicol, la rifampicine) ;
. influence des facteurs physiologiques ou pathologiques sur la pharmacocinétique de l'antibiotique ;
. transformation de la molécule in vivo ;
. inactivation de l'antibiotique par chélation (tétracyclines) ou par fixation sur des débris cellulaires (polymyxines) ;
. effets du pH (les aminosides sont inactifs à pH acide) ;
. état physiologique de la bactérie au sein du foyer infectieux (les bactéries "au repos" sont insensibles aux antibiotiques qui interfèrent avec la biosynthèse du peptidoglycane et il en va de même pour les formes L qui sont des mutants dépourvus de paroi) ;
. émergence d'une résistance au cours du traitement ;
. effets de l'antibiotique à concentration sub-inhibitrice sur le pouvoir pathogène (les quinolones et les tétracyclines inhibent, au moins partiellement, la synthèse des facteurs d'adhésion et une concentration insuffisante pour inhiber la croissance peut avoir une certaine efficacité in vivo) ;
. ...

Conclusion

Les difficultés techniques et les limites de validité évoquées ci-dessus ne doivent pas faire conclure à l'inutilité de l'antibiogramme. "Ça marche ! ". Cette affirmation de Chabbert semble également vraie en médecine vétérinaire. Il reste cependant beaucoup à faire pour utiliser au mieux cet examen. Des efforts de la part des laboratoires et des cliniciens sont nécessaires :
. Les laboratoires doivent rendre, le plus rapidement possible, des résultats plus explicites et plus sélectifs (sélectionner les antibiotiques utilisables sur le terrain, ne pas rendre des résultats non adaptés au cas clinique ou à l'espèce animale infectée...).
. Les cliniciens doivent interpréter les résultats. Sauf exceptions (par exemple, utilisation des macrolides dans les infections respiratoires des ruminants), une indication de résistance, doit inciter à ne pas utiliser l'antibiotique mais une indication de sensibilité doit conduire à une réflexion : l'antibiotique actif in vitro a-t-il une chance d'être efficace in vivo compte tenu du contexte clinique ?. L'antibiogramme n'est alors qu'un des éléments permettant d'instaurer une antibiothérapie. D'autres considérations cliniques, pharmacologiques, toxicologiques, financières... participent au choix du traitement.
. A l'occasion de l'analyse bactériologique, un dialogue doit s'instaurer entre le praticien et le responsable du laboratoire. Trop souvent, l'un ou l'autre des deux participants attribue à son interlocuteur des connaissances qu'il n'a pas obligatoirement.

Recherche des bêta-lactamases

Les enzymes inactivant les bêta-lactamines peuvent être détectées par différentes méthodes :
. Méthode acidimétrique
L'acidification résultant de la production d'acide pénicilloïque ou céphalosporoïque est détectée par le changement de coloration d'un indicateur de pH (rouge de phénol ou pourpre de bromocrésol). Des bandelettes ou des disques imprégnés de pénicilline G ou de céphalosporine et d'un indicateur de pH sont commercialisés.
. Méthode iodométrique
L'acide pénicilloïque réduit l'iode et cette réaction conduit à une décoloration d'un mélange iode - amidon.
. Méthode chromogénique
Le principe repose sur l'utilisation d'une céphalosporine changeant de coloration après hydrolyse. La molécule la plus utilisée est la nitrocéfine qui après action d'une bêta-lactamase vire du jaune au rouge. Des disques de papier imprégnés de nitrocéfine sont commercialisés.

Épreuves de bactéricidie

L'effet bactériostatique d'un antibiotique est souvent suffisant pour traiter une infection car l'inhibition de la multiplication bactérienne permet au système immunitaire de détruire l'agent infectieux. Par contre, dans les cas d'infections graves ou touchant des individus immunodéprimés, le traitement doit être bactéricide. Pour tester le pouvoir bactéricide d'un antibiotique sur la souche isolée il faut déterminer la concentration minimale bactéricide (CMB).

La CMB se définit comme la plus faible concentration d'antibiotique capable de détruire 99,99 p. cent d'un inoculum bactérien. Ce chiffre de 99,99 p. cent est un choix arbitraire.

La CMB est déterminée après une recherche de CMI en milieu liquide (technique de macrodilution ou de microdilution). La technique consiste à ensemencer sur un milieu gélosé dépourvu d'antibiotique, une quantité définie de tous les tubes ne présentant pas de croissance visible et à dénombrer les bactéries survivantes. Ce nombre est comparé au nombre de bactéries initialement présentes dans l'inoculum.

Les épreuves de bactéricidie sont sujettes à de nombreuses variations qui dépendent de facteurs biologiques et techniques :

- Facteurs biologiques :
. Bactéries persistantes :
Les bactéries persistantes, bactéries en phase stationnaire ou en phase de multiplication lente, échappent à l'action des antibiotiques actifs sur la biosynthèse du peptidoglycane.
. Effet paradoxal :
L'effet paradoxal se caractérise par une augmentation de la proportion de bactéries survivantes lorsque la concentration en antibiotique augmente au-delà de la CMB. Ce phénomène, observé principalement avec les bêta-lactamines, est mal compris mais il complique l'interprétation du test.
. Bactéries tolérantes :
Les bactéries tolérantes échappent à l'action létale d'un antibiotique alors que la croissance est inhibée et que la CMI n'est pas modifiée. La tolérance se caractérise par un rapport CMB / CMI égal ou supérieur à 32.

- Facteurs techniques :
Les difficultés techniques sont liées à la standardisation de l'inoculum, à la précision des volumes transférés, à la composition des milieux utilisés, au transfert d'antibiotique particulièrement important lorsque l'épreuve est faite sur des bactéries ayant une CMI élevée...

Recherche des pouvoirs bactériostatique et bactéricide du sérum

Ces examens ont pour but de vérifier que le sérum (ou éventuellement tout autre liquide organique) d'un malade recevant une antibiothérapie a un pouvoir bactériostatique ou bactéricide sur la souche responsable de l'infection. La dilution maximale du sérum capable d'inhiber la croissance du germe après 18 heures d'incubation correspond à l'activité bactériostatique. Dans un deuxième temps, la numération des survivants dans les tubes où aucune culture n'est visible permet de déterminer le pouvoir bactéricide (pourcentage de survivants de 0,01 p. cent). La détermination des pouvoirs bactériostatique et bactéricide du sérum constitue, en théorie, l'un des meilleurs examens de laboratoire permettant d'affirmer que le traitement administré est correct. A la connaissance de l'auteur, ils sont très rarement réalisés en médecine vétérinaire.

Deux prélèvements de sérum sont nécessaires. Ils doivent être effectués en tenant compte de la pharmacocinétique de l'antibiotique utilisé. Un premier prélèvement est effectué au moment du pic sérique soit 45 à 60 minutes après une injection intramusculaire, 15 minutes après une injection intraveineuse, 90 minutes après une administration orale (ces temps ont été définis pour l'espèce humaine). Le second prélèvement est réalisé au plus bas des concentrations sériques (vallées), soit juste avant une nouvelle administration d'antibiotique.

On admet qu'un sérum a un effet bactériostatique suffisant lorsque la plus grande dilution inhibitrice est au moins égale à la dilution 1/32 pour les pics et 1/2 pour les vallées.

Un traitement qui permet d'obtenir un pouvoir bactéricide du sérum de 99,99 p. cent à la dilution du 1/32 pour les pics et de 1/8 pour les vallées est considéré comme satisfaisant.

Épreuves de synergie

Introduction

L'utilisation d'une association d'antibiotiques est justifiée dans quatre cas :
. Élargir le spectre d'activité dans les cas d'infections à germes multiples.
. Traiter en urgence une infection grave non diagnostiquée.
. Prévenir la sélection de mutants résistants lors des traitements de longue durée.
. Obtention d'un effet synergique.

La prévention de la sélection de mutants résistants (par exemple, lors d'infections à mycobactéries ou à brucelles) et l'obtention d'un effet synergique avec, si possible, une action bactéricide rapide constituent les raisons essentielles de l'utilisation d'une association. La plus grande efficacité thérapeutique de certaines associations a été démontrée expérimentalement et/ou confirmée par l'expérience clinique.

L'interaction de deux antibiotiques peut produire quatre effets principaux :
. Indifférence : l'activité d'un antibiotique n'a aucune influence sur l'activité de l'autre.
. Addition : l'effet de l'association est égal à la somme des effets produits par chacun des antibiotiques pris isolément.
. Synergie : l'effet de l'association est supérieur à la somme des effets produits par chacun des antibiotiques pris isolément.
. Antagonisme : l'effet de l'association est inférieur à la somme des effets produits par chacun des antibiotiques pris isolément.

Mécanismes des associations synergiques

Facilitation de la pénétration

La pénétration d'un antibiotique dans la bactérie peut être facilitée par une autre molécule. Ce mécanisme est observé lors de l'association d'un antibiotique inhibant la synthèse de la paroi avec un aminoside. Ainsi, les bêta-lactamines ou la vancomycine facilitent la pénétration des aminosides en augmentant la perméabilité de la paroi. Cet effet synergique a été démontré pour les entérocoques, les streptocoques, Staphylococcus aureus subsp. aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa mais il n'est pas constaté pour toutes les souches de ces espèces.

Inhibition séquentielle d'une même voie métabolique

Les associations triméthoprime-sulfamides sont synergiques car il y a inhibition séquentielle de la dihydroptéroate synthétase et de la dihydrofolate réductase qui sont deux enzymes impliquées dans la synthèse des folates.

Inhibition de la synthèse de la paroi

Un effet synergique séquentiel se produit lors de l'association de la vancomycine avec une bêta-lactamine. L'association de deux bêta-lactamines se fixant sur des PLP différentes peut également avoir un effet synergique. Les PLP ou Protéines Liant les Pénicillines constituent les cibles d'action des bêta-lactamines.

Inhibition des bêta-lactamases

Une synergie par compétition d'affinité pour une bêta-lactamase peut être observée lors de l'association pénicilline G (ou ampicilline) avec la cloxacilline.
L'association d'un inhibiteur des bêta-lactamases tel que l'acide clavulanique avec l'amoxicilline permet à ce dernier antibiotique de conserver une efficacité sur des souches productrices de certaines bêta-lactamases.

Mécanismes des associations antagonistes

Association d'un antibiotique bactériostatique et d'une bêta-lactamine

Les antibiotiques bactériostatiques comme les tétracyclines, les macrolides ou les phénicolés diminuent l'activité bactéricide des bêta-lactamines car celles-ci ne sont actives que sur les bactéries en phase de multiplication. Cet antagonisme a été démontré in vitro et in vivo.

Associations d'antibiotiques actifs sur la sous-unité 50 S des ribosomes

Les associations macrolides-chloramphénicol ou macrolides-lincosamides ou macrolides-macrolides conduisent à une compétition pour la fixation sur la sous-unité 50 S des ribosomes ce qui produit un effet antagoniste.

Inhibition du transfert actif des aminosides

In vitro, l'association d'un aminoside avec un phénicolé ou une tétracycline inhibe le mécanisme de transfert actif nécessaire à la pénétration de l'aminoside dans la cellule bactérienne.

Induction de bêta-lactamases

L'association de deux bêta-lactamines peut être antagoniste si l'une d'elles est inductrice de bêta-lactamases. Exemples : associations pipéracilline-céfotaxime (ou ceftazidime ou imipénème) ; associations céfoxitine-céfamandole (ou ceftazidime ou carbénicilline).

Réalisation des épreuves de synergie

L'activité d'une association d'antibiotiques est variable en fonction des espèces bactériennes et pour une même espèce selon les souches. En théorie, il est donc nécessaire de vérifier l'activité de l'association envisagée sur chaque souche isolée. Il existe de nombreuses méthodes pour étudier les effets d'une association mais aucune d'elles n'est standardisée et elles sont généralement de mise en œuvre complexe. Le choix d'une méthode dépend donc des possibilités du laboratoire mais elles sont rarement effectuées dans un laboratoire de diagnostic vétérinaire.

Technique simplifiée utilisant une méthode de dilution en milieu liquide (figure 6)

Une même quantité de bouillon, ensemencé avec la souche bactérienne à étudier (10⁶ bactéries / mL), est répartie dans une série de tubes disposés selon un "schéma triangulaire". Dans chaque tube, l'adjonction de disques pour antibiogramme permet de réaliser les concentrations désirées des antibiotiques à étudier soit seuls soit en associations. Ces concentrations sont comprises dans les limites des concentrations sériques efficaces établis pour chaque antibiotique. Après 24 heures d'incubation, chaque tube ne présentant pas de culture visible sert à effectuer la numération des survivants réalisée en milieu gélosé. Le pourcentage de germes survivants est déterminé par comparaison de la densité des colonies avec un témoin inoculum.

Technique par diffusion

Deux techniques qualitatives permettent une évaluation, théoriquement simple, des effets bactériostatiques des associations :
. Le placement rapproché de deux disques, à la surface d'un milieu gélosé, permet de détecter les synergies ou les antagonismes les plus nets (figure 7).
. La disposition à angle droit de deux bandes de papier filtre imprégnées des solutions d'antibiotique permet, après observation de l'angle formé par la rencontre des deux zones d'inhibition, de déterminer l'effet de l'association (figure 8).

Technique par diffusion avec transfert sur cellophane

Deux bandes de papier filtre imprégnées d'une solution d'antibiotique sont disposées à angle droit sur un milieu gélosé non ensemencé. Après diffusion des antibiotiques, les bandes sont enlevées et on dispose sur la gélose une cellophane préalablement ensemencée avec la souche bactérienne. Au cours de l'incubation, les bactéries se multiplient directement sur la cellophane sauf dans les endroits où les concentrations en antibiotiques inhibent la croissance. Il est ainsi possible d'observer l'effet bactériostatique de l'association sur la souche bactérienne. La cellophane est ensuite transférée sur une gélose dépourvue d'antibiotique et après une nouvelle période d'incubation on note la croissance des bactéries survivantes. La croissance ou l'absence de croissance dans les zones de diffusion et d'intersection après transfert permet d'évaluer l'activité bactéricide de chaque antibiotique et de leur association.

Etude cinétique de l'activité bactéricide

D'autres méthodes ne sont utilisées que dans des laboratoires spécialisés. Il s'agit de la méthode de l'échiquier ou de l'étude cinétique de l'activité bactéricide.
Cette dernière technique est effectuée en milieu liquide. La méthode consiste à dénombrer les bactéries à intervalles de temps définis après un contact avec des antibiotiques seuls ou en association. Les antibiotiques sont utilisés à des concentrations correspondant à leurs concentrations sériques. Cette technique est de réalisation simple mais très laborieuse et nécessite d'effectuer de nombreux comptages successifs. Après avoir procédé à la numération des colonies, on trace les courbes de croissance (une pour chaque antibiotique et une pour l'association) et les résultats sont interprétés en comparant l'effet de l'association avec l'effet de l'antibiotique le plus actif :
. Si après 24 heures de contact l'effet de l'association est 100 fois plus bactéricide que celui de l'antibiotique le plus actif, il y a synergie.
. Si après 24 heures de contact l'effet de l'association est 100 fois moins bactéricide que celui de l'antibiotique le plus actif, il y a antagonisme.
. Si après 24 heures de contact l'effet de l'association est 10 fois plus ou 10 fois moins bactéricide que celui de l'antibiotique le plus actif, il y a indifférence ou addition.

Conclusion

La résistance bactérienne aux antibiotiques touche un nombre élevé de souches bactériennes d'origine humaine et animale et de nombreux tests, réalisés in vitro, apportent une aide pour le choix d'un traitement adapté. En médecine vétérinaire, les problèmes de coût ne permettent pas de réaliser la totalité de ces épreuves. En routine, les laboratoires de diagnostic vétérinaire ont recours à l'antibiogramme standard (diffusion en gélose) ou aux plaques ATB VET (bioMérieux). Le vétérinaire doit connaître les limites de ces tests pour interpréter au mieux les résultats.

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