J.P. Euzéby : Dictionnaire de Bactériologie Vétérinaire |
Créé le 21 février 2002
CLOSTRIDIUM DIFFICILE
Autre dénomination : "Bacillus difficilis".
Pouvoir pathogène pour l'homme
Pouvoir pathogène chez l'animal
Clostridium difficile est une bactérie bien connue des médecins car son pouvoir pathogène pour l'homme est connu depuis 1974 et, surtout, depuis 1978. Chez l'homme, les infections font suite à une perturbation de la flore intestinale permettant aux souches toxinogènes de se multiplier et d'excréter leurs toxines.
En médecine vétérinaire, même si quelques infections ont été décrites dès la fin des années 1970 et le début des années 1980, il fallut attendre 1983 et 1987 pour que les premiers cas d'infections naturelles soient observés chez le porc et chez le cheval. Par la suite, Clostridium difficile a été mis en cause chez d'autres espèces animales.
Il n'est pas toujours possible, notamment chez les carnivores domestiques et chez le porc, d'établir une relation directe entre la présence de souches toxinogènes de Clostridium difficile et l'apparition d'une pathologie. Toutefois, à tort ou à raison, Clostridium difficile est de plus en plus fréquemment incriminé comme une cause de morbidité et de mortalité néonatales dans les élevages de porcs, y compris dans les élevages français (G. Martineau, communication personnelle ; J. Szymanski, communication personnelle).
"Bacillus difficilis" a été découvert par Hall et O'Toole en 1935 dans l'intestin de nouveau-nés âgés de 2 à 10 jours. En 1938, Prévot transfère cette bactérie dans le genre Clostridium et la nomenclature de Clostridium difficile a été retenue par les Approved Lists of Bacterial Names.
Le genre Clostridium regroupe des espèces très diverses en ce qui concerne leurs activités métaboliques, leurs exigences nutritionnelles et les valeurs du G + C p. cent qui sont comprises entre 22 et 55.
L'étude phylogénétique de Collins et al. montre que les Clostridium sp. se répartissent en 19 groupes et ces auteurs placent Clostridium difficile dans le groupe XI. Pour Collins et al., le groupe XI pourrait représenter une nouvelle famille qu'ils appellent la famille 13 et au sein de laquelle ils reconnaissent 9 genres différents. Dans cette classification, Clostridium difficile appartient au genre 2 qui rassemble également Clostridium bifermentans, Clostridium irregulare, Clostridium ghonii, Clostridium glycolicum, Clostridium lituseburense, Clostridium mayombei, Clostridium mangenotii, Clostridium sordellii et Eubacterium tenue.
Les souches de Clostridium difficile sont constituées de bacilles à Gram positif, de 0,5 à 1,9 µm de diamètre sur 3,0 à 16,9 µm de longueur, parfois groupés en chaînes de 2 à 6 cellules, généralement mobiles grâce à une ciliature péritriche, anaérobies stricts, recouverts par une couche cristalline de surface (S-layer). La sporulation de la plupart des souches peut être obtenue en 48 heures après culture sur une gélose Brucella au sang. Les spores sont subterminales (parfois terminales), ovales et déformantes. Les souches de Clostridium difficile peuvent être toxinogènes et les principales toxines responsables du pouvoir pathogène sont la toxine A (parfois qualifiée d'entérotoxine) et la toxine B (parfois qualifiée de cytotoxine). Selon leur capacité à produire ces toxines, les souches de Clostridium difficile se répartissent en trois groupes : les souches A-/B-, les souches A+/B+ et les souches A-/B+.
Clostridium difficile hydrolyse l'esculine, il produit une L-proline-aminopeptidase et il acidifie le cellobiose (réaction faiblement positive), le fructose et le glucose.
Une réponse négative est obtenue pour les tests réduction des nitrates, production d'indole, lécithinase, lipase, hydrolyse de l'amidon, acidification de l'amidon, de l'amygdaline, de l'arabinose, du galactose, du glycogène, de l'inositol, de l'inuline, du lactose, du maltose, du mélibiose, du raffinose, du rhamnose, du ribose, du saccharose, de la salicine (réponse parfois faiblement positive), du sorbitol (réponse parfois faiblement positive), du tréhalose (réponse parfois faiblement positive) et du xylose (réponse parfois faiblement positive).
L'hydrolyse de la gélatine est généralement positive, l'acidification du mannitol, du mannose et du mélézitose est variable selon les souches.
La température optimale de croissance est comprise entre 30 et 37 °C mais la culture est également obtenue à 25 et à 45 °C.
En bouillon PYG, la croissance se traduit par un trouble, la présence d'un sédiment et une acidification (pH de 5 à 5,5 après 5 jours d'incubation). Les principaux acides volatils produits sont les acides acétique, isobutyrique, butyrique, isovalérique, valérique, isocaproïque, formique et lactique.
Sur gélose au sang, après 24 heures d'incubation, les colonies sont circulaires ou à contour irrégulier, elles sont plates ou légèrement convexes, opaques, blanchâtres ou grisâtres et leur diamètre est compris entre 2 et 5 mm. Les colonies observées à la loupe binoculaire ont un aspect en verre brisé et l'odeur des cultures évoque celle du crottin de cheval. Après 48 d'incubation, les colonies obtenues sur gélose Brucella au sang enrichie en hémine et en vitamine K1 présentent une fluorescence vert pâle sous lumière ultraviolette.
Clostridium difficile est retrouvé dans le sol ou l'eau (sous forme sporulée) et il est présent dans l'intestin de l'homme et de nombreuses espèces animales (y compris les oiseaux et les reptiles).
Une étude publiée en 1996 et réalisée dans la région de Cardiff montre que Clostridium difficile est largement répandu dans le milieu extérieur. En effet, cette bactérie a été isolée de 87,5 p. cent des 16 échantillons d'eau prélevés dans 4 rivières différentes, de 46,7 p. cent des échantillons d'eau prélevés dans des lacs, de 44 p. cent des 15 échantillons d'eau de mer, de 50 p. cent des 8 échantillons d'eau de piscine, de 21 p. cent de 104 prélèvements de sol et de 2,4 p. cent des 300 échantillons de végétaux crus.
Chez les animaux la même étude montre que le portage n'excède pas 1,6 p. cent chez les bovins, les ovins, les porcs ou les volailles et que Clostridium difficile ne semble pas présent dans l'intestin des poissons. Les chiffres concernant d'autres espèces animales seront donnés ci-dessous.
Chez l'homme, le portage varie de 0 à 3 p. cent chez les adultes sains et il peut atteindre 6 à 11 p. cent chez les individus préalablement hospitalisés ou préalablement traités aux antibiotiques. En cours d'hospitalisation, Clostridium difficile est mis en évidence chez 4 à 21 p. cent des patients et, lors d'un épisode infectieux dans un service hospitalier, jusqu'à 32 p. cent des patients peuvent héberger cette bactérie. En effet, les individus malades excrètent de nombreux germes aptes à résister sous forme sporulée dans le milieu extérieur et pouvant être disséminés soit par les mains du personnel soignant soit par des objets contaminés soit par du matériel médical comme les thermomètres. En milieu hospitalier, les risques de contamination sont favorisés par la promiscuité des malades et par une utilisation importante des antibiotiques.
Chez les nouveau-nés, le portage peut concerner jusqu'à 70 p. cent des individus mais il diminue durant les premiers mois de la vie, pour atteindre, vers l'âge de deux ans, une fréquence comparable à celle de l'adulte.
Pouvoir pathogène pour l'homme
Chez les nouveau-nés et chez les jeunes enfants, les pathologies à Clostridium difficile sont rares alors que le portage de souches toxinogènes existe et que la concentration en toxines dans les selles peut être comparable à celle des adultes malades. Cet état de résistance est encore mal compris mais il ne semble pas dû à des facteurs présents dans le lait maternel car les infections ne sont pas plus fréquentes chez les nouveau-nés nourris avec du lait en poudre. L'absence de récepteurs ou l'immaturité des récepteurs des cellules intestinales pour les toxines est l'hypothèse la plus souvent avancée.
Chez les adultes, la situation est totalement différente et Clostridium difficile est principalement responsable de colites pseudo-membraneuses et de diarrhées consécutives à une prise d'antibiotiques. Dans la très grande majorité des cas les maladies à Clostridium difficile sont donc des maladies iatrogènes et notamment des maladies nosocomiales.
Les antibiotiques agissent en perturbant la composition des flores intestinales et en permettant la colonisation de l'intestin par des souches endogènes ou plus fréquemment exogènes.
À l'exception des aminosides administrés par voie parentérale, pratiquement tous les antibiotiques peuvent favoriser la survenue d'une infection à Clostridium difficile. Les molécules les plus fréquemment impliquées sont celles ayant un spectre d'action large et susceptibles de perturber fortement les flores notamment à la suite d'une administration orale. Parmi elles, on peut citer les aminopénicillines, les aminopénicillines associées à des inhibiteurs des bêta-lactamases, les céphalosporines et la clindamycine. Inversement, le triméthoprime, la rifampicine et les fluoroquinolones sont plus rarement en cause. De manière paradoxale, des antibiotiques actifs sur Clostridium difficile peuvent déclencher un épisode infectieux. Ce paradoxe peut s'expliquer par le fait que les spores de Clostridium difficile, résistantes à tout antibiotique, vont pouvoir germer et donner des formes végétatives aptes à coloniser l'intestin dès que la pression exercée par les antibiotiques diminue. Si les cas d'infection surviennent plus fréquemment après des traitements prolongés ou à la suite de traitements associant plusieurs antibiotiques, ils peuvent aussi survenir après une prophylaxie effectuée avec une dose unique d'antibiotique.
Outre les traitements antibiotiques, les traitements chimiothérapiques anticancéreux peuvent également entraîner des diarrhées à Clostridium difficile. Les molécules les plus fréquemment incriminées sont le méthotrexate, la doxorubicine, la cyclophosphamide et le 5-fluorouracile.
Le principal facteur de risque est lié à l'âge et plus de 80 p. cent des cas sont observés chez des individus âgés de plus de 60 ans. Les autres facteurs de risque sont représentés par des opérations chirurgicales portant sur le tube digestif et par l'administration de laxatifs, de lavements barytés, d'antiacides ou de ralentisseurs du transit. Tous ces facteurs semblent agir en modifiant l'écosystème digestif ou la motilité intestinale.
L'immunité permet d'expliquer, au moins partiellement, les différences de gravité observées. En effet, les taux d'IgG circulantes et d'IgA sécrétoires sont plus faibles chez les patients présentant les colites les plus graves ou des rechutes que chez ceux souffrant d'une diarrhée plus banale et non récidivante.
Même en l'absence de mortalité, les infections de l'homme sont parfois graves et elles entraînent des coûts importants notamment en raison d'une augmentation de la durée d'hospitalisation qui est en moyenne de 8 jours pour les adultes et de 36 jours pour les jeunes enfants. De plus, la survenue d'une épidémie hospitalière peut provoquer la fermeture temporaire d'un service et une augmentation du nombre de lits inoccupés.
Depuis 2003, une souche particulière de Clostridium difficile, le clone 027, est responsable d’infections nosocomiales sévères et épidémiques. D’abord détectée au Canada et aux Etats-Unis, elle a été impliquée plus récemment dans des épidémies hospitalières en Grande-Bretagne, en Belgique et aux Pays-Bas. La première épidémie due au clone 027 a été détectée en France en mars 2006. À la date du 03 octobre 2006, la souche 027 a été retrouvée dans 19 épisodes d'infections signalées dans des établissements de santé ou des maisons de retraite du Nord-Pas de Calais.
La colite pseudo-membraneuse se caractérise par une infiltration inflammatoire intense de la muqueuse du côlon et du rectum ainsi que par la présence de fausses membranes fibrineuses adhérentes à la muqueuse. Le principal signe clinique est une diarrhée aqueuse, muqueuse ou rarement hémorragique. Ces infections peuvent être graves et le taux de mortalité atteint 0,6 p. cent voire même 35 à 50 p. cent lors de la survenue d'un mégacôlon ou d'une perforation du côlon. Les enquêtes épidémiologiques montrent que plus de 95 p. cent des cas de colite pseudo-membraneuse sont liés à la colonisation de l'intestin par des souches de Clostridium difficile toxinogènes.
Clostridium difficile est la principale étiologie des diarrhées consécutives à une antibiothérapie. En pratique ambulatoire, il serait à l'origine de 8 à 10 p. cent des cas et il est reponsable de 10 à 25 p. cent des diarrhées survenant en cours d'hospitalisation. Dans certains hôpitaux, Clostridium difficile est la bactérie entéropathogène la plus fréquemment isolée des selles.
L'isolement de Clostridium difficile à partir de prélèvements autres que les selles ou l'intestin est beaucoup plus rare. Cette bactérie peut être isolée de bactériémies, de péritonites, d'abcès intra-abdominaux, d'infections de plaies chirurgicales, d'abcès du cerveau, d'ostéomyélites... Ces infections extra-intestinales présentent quelques caractères particuliers : (i) les souches isolées peuvent être non toxinogènes ; (ii) les infections ne succèdent pas toujours à une antibiothérapie et (iii) les infections surviennent parfois chez de très jeunes enfants.
La responsabilité de Clostridium difficile dans les infections extra-intestinales est souvent difficile à établir car les souches sont souvent isolées en association avec d'autres bactéries. Toutefois, des cultures pures ont été obtenues à partir d'abcès hépatique, splénique et pancréatique.
Pouvoir pathogène chez l'animal
Chevaux
Chez le cheval, le taux de portage semble faible (à moins qu'il ne soit sous estimé) et, selon diverses enquêtes, Clostridium difficile est retrouvée chez moins de 4 p. cent des animaux.
La première étude impliquant Clostridium difficile dans les infections du cheval a été publiée en 1987. Cette étude portait sur des poulains, non traités aux antibiotiques et atteints de diarrhée ou d'entérite hémorragique nécrosante. Les résultats montraient que 63 p. cent des animaux hébergeaient Clostridium difficile et que les toxines étaient détectées chez 65 p. cent d'entre eux. En revanche cette bactérie n'était pas mise en évidence chez des poulains et des adultes sains. En 1988, Jones et al. ont reproduit la maladie en faisant ingérer à des poulains une souche de Clostridium difficile isolée d'un poulain malade.
Par la suite, Clostridium difficile a été mis en évidence, aussi bien chez les poulains que chez les adultes, dans des cas de diarrhée et dans des cas d'entérocolite souvent consécutives à l'administration d'antibiotiques. Le rôle des antibiotiques et notamment de l'érythromycine a été illustré par une étude suédoise montrant que l'association érythromycine-rifampicine, classiquement utilisé chez les poulains atteints de pneumonie à ¤ Rhodococcus equi, pouvait conduire à une colite sévère chez les juments. L'érythromycine est excrétée dans les fèces des poulains et l'absorption par coprophagie, même en quantité minime, de cet antibiotique par les juments est susceptible d'altérer la flore digestive et de déclencher une entérocolite. La rifampicine ne semble pas en cause si bien que cette étude a conduit quelques vétérinaires à utiliser une association gentamicine-rifampicine pour traiter les infections à ¤ Rhodococcus equi.
Cliniquement, les poulains présentent une diarrhée qui dans environ 50 p. cent des cas peut être hémorragique, une déshydration, des coliques et une dyspnée. Chez les adultes, l'infection se traduit par une diarrhée qui peut être modérée ou intense, une perte d'appétit, des coliques et parfois une mort subite. À l'autopsie, le contenu intestinal est fluide, la muqueuse présente des lésions de nécrose (superficielle ou profonde), parfois un œdème modéré et elle peut être recouverte d'un exsudat fibrino-hémorragique.
Un cheval atteint de diarrhée va contaminer l'environnement dans lequel Clostridium difficile peut survivre très longtemps sous forme sporulée. Cette contamination du milieu extérieur, mise en évidence dans des cliniques hospitalisant des chevaux, pourrait être à l'origine de contaminations nosocomiales.
Carnivores
Comme chez de nombreuses espèces animales, Clostridium difficile est présent dans l'intestin des carnivores. Selon les enquêtes, de 0 à plus de 40 p. cent des chiens ou des chats adultes hébergent des souches toxinogènes ou non toxinogènes de Clostridium difficile sans présenter de troubles digestifs. Chez les chiots âgés de moins de 10 semaines, le portage est beaucoup plus fréquent et 94 p. cent des chiots peuvent être des porteurs transitoires de germes. Ce portage est observé plus fréquemment chez des animaux hospitalisés et des souches de Clostridium difficile peuvent être isolées des locaux ou du matériel des cliniques vétérinaires.
Des cas de diarrhée à Clostridium difficile ont été décrits chez le chien et chez le chat. La mise en cause de cette bactérie repose sur la mise en évidence de toxines dans les fèces et sur l'efficacité fréquente d'un traitement par le métronidazole. Aussi bien chez le chien que chez le chat, ces diarrhées ne sont pas toujours consécutives à un traitement antibiotique et si Clostridium difficile est bien l'agent étiologique de ces pathologies, d'autres facteurs de risque doivent exister.
Le portage de souches éventuellement toxinogènes par les chiens et les chats pose le problème d'un éventuel risque de transmission à l'homme. À la connaissance de l'auteur, aucune transmission de l'animal à l'homme n'a été identifiée, mais les personnes âgées et/ou immunodéprimées, recevant un traitement antibiotique, devraient éviter les contacts avec un animal familier.
Porcs
Le premier cas d'infection chez le porc semble avoir été décrit chez des animaux SPF présentant une colite muco-hémorragique. L'inoculation de la souche à des porcs axéniques a permis d'observer de l'inappétence et une congestion du côlon dont la muqueuse était recouverte d'un exsudat mucopurulent.
En élevage conventionnel, Clostridium difficile a été isolé chez deux porcs âgés de huit semaines et présentant une diarrhée modérée et un amaigrissement important.
Depuis quelques années, plusieurs études suggèrent que Clostridium difficile est responsable de morbidité et de mortalité dans la phase du pré-sevrage. Les animaux, le plus souvent âgés de moins de 7 jours, sont amaigris, ils présentent des épanchements thoraciques et abdominaux et éventuellement de la diarrhée. À l'autopsie, les principales lésions sont un œdème du côlon et une typhlocolite et le côlon renferme un contenu plus ou moins fluide de couleur jaunâtre. Les examens histologiques révèlent la présence de foyers suppurés dans la lamina propria du côlon, une infiltration par des neutrophiles, des érosions de la muqueuse, des foyers d'exsudation de mucus et de fibrine et la présence de bacilles parfois sporulés. Occasionnellement, des lésions comparables sont observées dans l'iléon.
D'après Yaeger, la maladie a été reproduite en faisant ingérer à des porcelets des cultures de Clostridium difficile isolées d'animaux malades, les animaux inoculés présentent un œdème du côlon, ils permettent l'isolement de la souche d'épreuve et des toxines sont mises en évidence dans leur fèces.
Le rôle de Clostridium difficile en tant qu'agent étiologique est cependant difficile à établir. En effet, si la présence de toxines est détectée chez environ 42 p. cent des porcelets malades, environ 74 p. cent des porcelets sains présentent également des toxines dans leurs fèces. De plus, les fèces des animaux présentant un œdème du côlon ou une colite ne permettent pas toujours la mise en évidence de toxines. Le principal argument suggérant que Clostridium difficile est naturellement pathogène pour les porcelets tient à la quantité de toxine qui semble plus importante chez les animaux malades que chez les animaux sains.
Si on tient du fait que Clostridium difficile est un germe présent dans l'environnement et que les individus jeunes, aux flores encore imparfaitement constituées, peuvent être des porteurs de germes, il semble nécessaire d'attendre les résultats d'études complémentaires avant d'affirmer que cette bactérie est un agent pathogène majeur chez les porcs non sevrés.
Autres espèces animales
Dans les conditions expérimentales ou après un traitement antibiotique, le hamster, le cobaye, la souris et le rat sont sensibles à Clostridium difficile. Chez le hamster, des diarrhées liquides accompagnées d'une mortalité élevée ont été observées chez des animaux non traités aux antibiotiques et nourris avec un alimentation riche en graisse ou en cholestérol. Chez ces animaux, contrairement à ce qui est observé chez les hamsters recevant une antibiothérapie, la flore intestinale n'est pas altérée ce qui suggère l'intervention d'autres facteurs de risque.
Dans les conditions naturelles, des infections à Clostridium difficile ont été décrites chez des levrauts âgés de moins de 10 jours et présentant une diarrhée suivie d'une mortalité élevée.
Chez le lapin, des diarrhées aqueuses et des entérotoxémies mortelles ont été observées à la suite de traitements à la pénicilline ou à l'ampicilline et chez des animaux SPF n'ayant pas reçu d'antibiotiques. Ces infections sont toutefois moins fréquentes que les infections à ¤ Clostridium spiroforme.
Un cas de diarrhée consécutif à un traitement antibiotique a été décrit chez un ours (Ursus arctos) dans un zoo des USA, un cas d'entérite pseudo-membraneuse a été décrit chez un pingouin (Eudyptes chrysolophus) traité à la ciprofloxacine et des entérites ont été observées chez des autruches (Struthio camelus) élevées en captivité.
Les toxines de Clostridium difficile ont été mises en évidence chez des macaques (Macaca fascicularis, Macaca nemestrina) et cinq cas de mortalité ont été décrits chez des tamarins (Saguinus oedipus) ayant reçu un traitement antibiotique (érythromycine ou norfloxacine) en vue de traiter des diarrhées à Campylobacter sp.
Clostridium difficile possède de nombreux facteurs de pathogénicité et, comme c'est le cas pour d'autres bactéries, tous les facteurs de pathogénicité ne sont pas exprimés par toutes les souches.
L'adhésion aux cellules intestinales, favorisée par la mobilité de la bactérie et par un chimiotactisme pour le mucus intestinal, a été démontrée dès 1979 mais la nature des adhésines n'est pas encore connue avec certitude. On a évoqué l'intervention de pili, le rôle des flagelles, le rôle de la couche cristalline de surface, la présence de protéines de 27 et de 40 kDa, des interactions électriques et même une intervention de la toxine A.
La résistance à la phagocytose pourrait être due à la présence de polysaccharides de surface.
Les lésions tissulaires pourraient partiellement résulter de l'action d'enzymes hydrolytiques (hyaluronidase, chondroïtine sulfatase, gélatinase et collagénase).
Le pouvoir toxinogène résulte de l'action de 5 toxines éventuellement excrétées par les souches de Clostridium difficile :
- Les toxines A et B ont été les plus étudiées et leur étude est envisagée ci-dessous.
- Une entérotoxine protéique instable et non purifiée a été mise en évidence par quelques auteurs. Son rôle dans le pouvoir pathogène de Clostridium difficile est encore inconnu.
- Une protéine de haut poids moléculaire apte à perturber le potentiel électrique des cellules intestinales et une ADP-ribosyltransférase, produite uniquement par quelques souches, ne semblent pas jouer un rôle important dans la pathogénie.
En fait, le pouvoir pathogène de Clostridium difficile semble reposer avant tout sur la production des toxines A et B. Ces deux toxines, codées par deux gènes portés par un même locus de pathogénicité, sont constituées d'une unique chaîne peptidique de 308 kDa pour la toxine A et de 270 kDa pour la toxine B. Ces deux toxines présentent une forte homologie de séquence et sur le plan fonctionnel elles sont constituées de trois domaines. Le domaine doué d'une activité toxique est situé à l'extrémité NH2 terminale, le domaine responsable de la fixation aux cellules, formé d'unités répétés, est situé à l'extrémité COOH terminale de la chaîne peptidique et au milieu de la chaîne peptidique se situe une région qui semble impliquée dans la pénétration dans les cellules.
Ces deux toxines sont cytotoxiques pour de nombreuses cellules, elles augmentent la perméabilité capillaire et elles peuvent provoquer des hémorragies (activité plus marquée pour la toxine A). La toxine A est capable de provoquer un afflux liquidien dans de nombreux modèles expérimentaux alors que cet effet n'est généralement pas observé avec la toxine B. Toutefois, la toxine B semble renforcer l'action de la toxine A et des souches produisant uniquement de la toxine B sont aptes à provoquer des infections expérimentales et elles sont douées d'un pouvoir pathogène naturel. Ces souches A-/B+ sont très rares en France mais elles représentent jusqu'à 3 p. cent des souches anglaises et galloises et elles ont été mises en cause dans une épidémie observée dans un hôpital canadien.
Les souches de Clostridium difficile ne produisant aucune de ces deux toxines ne sont pas pathogènes. Chez ces souches, le locus de pathogénicité est remplacé par une séquence de 127 bases ne codant pour aucune protéine.
Après fixation sur un récepteur cellulaire (la nature du récepteur pour la toxine B est inconnue), les toxines pénètrent dans la cellule par endocytose avant d'être libérées dans le cytoplasme. Elles provoquent alors une glycosylation des protéines liant le GTP, telles que les protéines Rho (glycosylation de la thréonine en position 37), Rac et Cdc42Hs qui sont impliquées dans la formation du cytosquelette. La désagrégation du cytosquelette conduit à un arrondissement des cellules et à une altération des jonctions cellulaires. La désorganisation des épithéliums résulte également d'une activation des mécanismes apoptotiques mise en évidence aussi bien avec la toxine A qu'avec la toxine B. Il s'en suit une augmentation de la perméabilité se traduisant par de la diarrhée. Dans les conditions naturelles, les cellules épithéliales du côlon sont les plus affectées. Expérimentalement, la toxine B est 100 à 1000 fois plus cytotoxique que la toxine A.
Les infections à Clostridium difficile se caractérisent par un afflux massif de neutrophiles et/ou la formation de micro-abcès ou de pseudo-membranes riches en neutrophiles. Cet afflux de neutrophiles résulte de la libération de TNFalpha et d'IL-8 par les monocytes et les macrophages, d'une stimulation de la phospholipase A2 (ce qui conduit à la synthèse de prostaglandines et de leucotriènes) ainsi que de la libération de TNFalpha et d'histamine par les mastocytes. Les toxines A et B sont capables de stimuler la libération de cytokines produites par les monocytes et les macrophages alors que seule la toxine A semble capable de déclencher la synthèse de prostaglandines et de leucotriènes et d'activer les mastocytes.
Le rôle de la toxine A dans la synthèse des cytokines pro-inflammatoires passerait par la libération de substance P, un peptide de 11 acides aminés ayant un rôle de médiateur pour de nombreux neurones y compris les neurones sensitifs de la sous-muqueuse intestinale et connue pour stimuler différentes cellules dont les mastocytes et les macrophages. L'importance de la substance P a été démontrée chez le rat car les animaux traités par un antagoniste de la substance P sont moins sensibles à l'action de la toxine A. Selon Pothoulakis et al. la séquence des événements pourrait être la suivante : (i) la fixation de la toxine A sur les entérocytes entraîne la libération de cytokines par ces cellules; (ii) ces cytokines diffusent dans la lamina propria et stimulent les terminaisons nerveuses des neurones de la sous-muqueuse ; (iii) en réponse à cette stimulation les neurones libèrent la substance P qui à son tour stimule les mastocytes et les macrophages ; (iv) les cytokines produites par ces cellules induisent la sécrétion de liquide par les cellules intestinales et l'afflux des neutrophiles.
Les mastocytes semblent avoir un rôle important dans la pathogénie des infections à Clostridium difficile car, par comparaison avec des souris normales, des souris dépourvues de mastocytes sont moins sensibles à l'action de la toxine A.
Le diagnostic d'une infection à Clostridium difficile repose sur la mise en évidence du germe ou de ses toxines. Aux USA, la détection des toxines est considérée comme le meilleur moyen de diagnostic alors qu'en Europe on préfère y associer la culture du germe. Les techniques de diagnostic moléculaire, notamment l'utilisation de sondes ou de techniques PCR, ne semblent pas donner de meilleurs résultats que les techniques conventionnelles.
Chez l'homme, seules les selles liquides font l'objet d'une recherche de Clostridium difficile et de ses toxines et il ne semble pas utile de répéter les analyses en cas de réponse négative. Chez l'animal, la diarrhée peut être modérée ou absente et la recherche du germe ou de ses toxines peut être entreprise sur des fèces même non diarrhéiques si les commémoratifs y incitent. De même, au moins chez le cheval, la répétition des prélèvements est conseillée car le germe ou ses toxines ne sont parfois détectés que 5 jours après l'apparition des premiers signes cliniques.
La recherche de la toxine doit s'effectuer sur des prélèvements de fèces fraîches ou, si l'analyse ne peut être effectuée immédiatement, sur des fèces conservées à + 4 °C. En effet les toxines se dénaturent à 22 °C et elles ne sont plus mises en évidence dans 20 p. cent des prélèvements acheminés par voie postale sans réfrigération.
Chez le porc, il existe une très bonne corrélation entre la mise en évidence de la toxine dans le contenu du côlon et sa mise en évidence dans les écouvillonnages rectaux si bien que des écouvillons, à condition d'être conservés au froid, constituent un bon prélèvement.
Les formes végétatives de Clostridium difficile perdent rapidement leur viabilité lorsque le prélèvement est conservé dans une atmosphère normale et elles donnent naissance à des spores. En revanche, si le prélèvement est placé dans un milieu de transport pour bactéries anaérobies, la forme végétative survit au moins 30 jours à + 4 °C.
Le plus souvent, la perte de viabilité des formes végétatives n'est pas considérée comme un problème important car, in vitro, il est possible de favoriser la germination des spores à l'aide de techniques particulières (Cf. infra). Un vétérinaire praticien ne connaît pas toujours la méthodologie utilisée par son laboratoire de diagnostic et il ne peut savoir si celui ci appliquera une technique apte à favoriser la germination des spores. Aussi, pour éviter des réponses faussement négatives, il est conseillé d'envoyer les prélèvements de fèces dans un milieu de transport pour anaérobies et de les conserver à + 4 °C.
En l'absence de milieux sélectifs, l'isolement de Clostridium difficile est délicat car sa croissance peut être masquée par les autres bactéries de la flore fécale (d'où le qualificatif de difficile donné à cette clostridie). L'introduction du milieu CCFA* (Cycloserine Cefoxitin Fructose Agar), milieu sélectif le plus utilisé, permet l'isolement de 2 X 103 bactéries dans un gramme de matières fécales sèches contenant 6 X 1010 bactéries. Les fèces sont ensemencées directement, sans dilution initiale, et les boîtes sont incubées 48 heures en anaérobiose. Le fait d'utiliser des géloses préalablement incubées en anaérobiose permet d'augmenter la sensibilité et, d'une manière générale, une anaérobiose rapide augmente les chances d'isolement.
La sensibilité est également favorisée par les procédés aptes à favoriser la germination des spores. Deux techniques sont couramment utilisées : 1) l'incorporation de 1g/L de taurocholate de sodium dans le milieu ; 2) un traitement préalable des fèces à l'éthanol (homogénéiser 1 mL du prélèvement dans 1 mL d'éthanol à 95 et laisser 1 heure à température ambiante avant d'ensemencer une gélose CCFA).
La recherche de Clostridium difficile dans l'environnement peut s'effectuer à l'aide de boîtes de contact (dites aussi boîtes de Rozier-Pantaléon ou boîtes RODAC) contenant du milieu CCFA. La survie dans l'environnement ne pouvant se faire que sous forme sporulée, l'addition de taurocholate de sodium au milieu de culture est indispensable. Une autre technique consiste à utiliser des écouvillons humides qui, après badigeonnage des surfaces, sont placés dans des tubes contenant 10 mL de thioglycolate semi-solide (agar à 2 pour mille), 1 g/L de taurocholate de sodium, 100 µg/mL de cyclosérine et 1 µg/mL de céfotaxime. Les milieux incubés à 37 °C sont examinés durant 5 jours et, en cas de croissance bactérienne, ils sont repiqués sur gélose CCFA.
Sur milieu CCFA au jaune d'œuf, les colonies de Clostridium difficile sont jaunes, mates, irrégulières, d'un diamètre de 2 à 10 mm et à la loupe binoculaire elles ont un aspect en verre brisé. Sur milieu CCFA au sang de cheval, les colonies sont identiques mais leur couleur est grise. Dans tous les cas, l'odeur particulière des cultures permet également d'orienter le diagnostic. Clostridium difficile est sensible à l'oxygène et sur les milieux sélectifs la sporulation n'est pas toujours observée. Aussi, pour éviter une perte des souches, les colonies doivent être repiquées dans les 30 minutes suivant l'ouverture des jarres.
L'identification peut se réaliser par l'analyse des acides volatils par chromatographie en phase gazeuse. La production d'acide isocaproïque, d'acide isovalérique et d'acide valérique est en effet caractéristique de ce germe. L'analyse des acides volatils est rapide et fiable mais elle n'est pas à la portée de tous les laboratoires. Les techniques biochimiques classiques permettent également l'identification mais l'utilisation de galeries miniaturisées donne des résultats variables selon les kits. Toutefois, la galerie API 20A donne un pourcentage d'identification correcte de 95,5.
Fedorko et Williams préconisent d'identifier Clostridium difficile par ses caractères morphologiques, ses caractères culturaux et la production de L-proline-aminopeptidase révélée par l'utilisation du système PRO Disc (Carr-Scarborough Micobiologicals). Les résultats obtenus par ces auteurs (et largement confirmés par García et al.) montrent que toutes les souches de Clostridium difficile cultivent sur milieu CCFA et donnent une réponse positive au test L-proline-aminopeptidase. Clostridium sordellii et Clostridium sporogenes produisent une L-proline-aminopeptidase mais ils ne cultivent pas sur le milieu CCFA. Clostridium innocuum pousse sur le milieu CCFA en donnant des colonies proches de celles de Clostridium difficile mais cette bactérie ne produit pas de L-proline-aminopeptidase. Clostridium glycolicum et Clostridium bifermentans donnent une réponse positive au test L-proline-aminopeptidase, ils cultivent sur milieu CCFA mais leurs colonies n'ont pas l'aspect des colonies de Clostridium difficile.
L'identification du germe est lente mais elle est considérée comme la technique la plus sensible, elle permet la détection de Clostridium difficile dans l'environnement et elle permet un typage des souches. Son principal inconvénient est qu'elle ne permet pas de distinguer les souches toxinogènes des souches non toxinogènes si bien qu'en l'absence de mise en évidence des toxines dans les selles, il faut vérifier le caractère toxinogène des souches isolées in vitro.
Plusieurs techniques de typage ont été développées afin de mieux comprendre l'épidémiologie des infections à Clostridium difficile. Parmi celles ci on peut citer le sérogroupage (agglutination des souches à l'aide de sérums produits chez le lapin) qui permet de reconnaître au moins 19 sérogroupes, l'électrophorèse des protéines en gel de polyacrylamide, l'analyse des profils de macro-restriction, la RAPD (random amplified polymorphic DNA), le ribotypage... Ce sont ces techniques qui ont permis de démontrer la transmission du germe entre malades et la réalité des épidémies nosocomiales. Sur le plan mondial, des groupes de travail ont été mis en place et leurs principaux résultats ont été analysés par Brazier en 2001.
La recherche d'une activité cytotoxique dans un filtrat de fèces est souvent considérée comme la méthode de référence. De nombreuses lignées cellulaires peuvent être utilisées (Vero, Hep2, CHO, HeLa, MRC-5...) mais les cellules Vero semblent les plus sensibles. Le filtrat est obtenu en centrifugeant une suspension de fèces au 1:5 dans du tampon phosphate puis en filtrant le surnageant sur un filtre de porosité de 0,22 µm. Un aliquot du filtrat est mis au contact d'un tapis cellulaire confluent et un effet cytotoxique est recherché après 6 heures, 24 heures et 48 heures d'incubation. Un effet cytotoxique se traduit par un étirement et une augmentation de la réfringence des cellules suivis d'un détachement et d'un arrondissement des cellules. L'effet cytotoxique résulte principalement de l'action de la toxine B et sa spécificité est vérifiée par sa neutralisation obtenue avec un sérum anti-Clostridium difficile ou anti-Clostridium sordellii (la toxine létale de Clostridium sordellii et la toxine B de Clostridium difficile présentent suffisamment de communautés antigéniques pour permettre une telle neutralisation croisée). Cette technique est sensible, spécifique (à condition d'effectuer les tests de neutralisation) mais elle nécessite l'utilisation de cultures cellulaires.
Plusieurs kits commercialisés détectent la présence des toxines dans les fèces par une technique immuno-enzymatique. La plupart des kits détectent la toxine A mais certains d'entre eux détectent également la toxine B ce qui permet de diagnostiquer les infections dues à des souches A-/B+. Certains de ces kits ont un conditionnement unitaire et se caractérisent par une manipulation simplifiée et rapide. Ces techniques immuno-enzymatiques sont moins sensibles que la mise en évidence d'un effet cytotoxique mais elles donnent un résultat rapide et elles peuvent être mises en œuvre par tous les laboratoires.
Le test "Triage® C. difficile Panel" (Biosite Diagnositcs Inc.) permet la détection simultanée de la toxine A et d'un antigène (la glutamate déshydrogénase) commun à toutes les souches de Clostridium difficile. Le principal avantage de ce test est d'avoir une valeur prédictive négative de pratiquement 99,7 p. cent lorsque les résultats sont négatifs pour la mise en évidence de la toxine A et pour la recherche de l'antigène commun. La mise en évidence de l'antigène commun en l'absence de toxine A nécessite des examens complémentaires.
La détermination in vitro de la sensibilité aux antibiotiques des souches de Clostridium difficile n'est pas toujours effectuée en routine. Une étude réalisée sur 198 souches isolées en France (100 souches isolées en 1991 et 98 souches isolées en 1997) montrent que les antibiotiques les plus actifs sont le métronidazole, la vancomycine et la teicoplanine. En ce qui concerne les autres antibiotiques 64 p. cent des 198 souches présentaient une concentration minimale inhibitrice supérieure ou égale à 1 µg/mL vis-à-vis de l'érythromycine, 80 p. cent des souches avaient une CMI supérieure ou égale à 2 µg/mL vis-à-vis de la clindamycine, 23,7 p. cent des souches avaient une CMI supérieure ou égale à 8 µg/mL vis-à-vis de la tétracycline, 22,7 p. cent des souches avaient une CMI supérieure ou égale à 4 µg/mL vis-à-vis de la rifampicine et 14,6 p. cent des souches avaient une CMI supérieure ou égale à 16 µg/mL vis-à-vis du chloramphénicol.
Le simple arrêt de l'antibiothérapie permet une guérison spontanée chez environ 15 à 25 p. cent des patients. Toutefois, un traitement est parfois nécessaire et il fait généralement appel au métronidazole qui est moins coûteux que la vancomycine ou la teicoplanine et dont l'emploi permet d'éviter la sélection de souches, notamment de souches d'entérocoques, résistantes aux glycopeptides. Après traitement, les rechutes sont fréquentes mais elles sont dues à une réinfection des malades par des spores et non à l'apparition de souches résistantes.
Le traitement des individus porteurs sains de germes n'est pas recommandé. Un traitement par le métronidazole s'est avéré inefficace et la vancomycine, bien qu'entraînant temporairement la disparition de Clostridium difficile, conduit à un taux de portage plus élevé (par comparaison avec l'administration d'un placebo) deux mois après l'arrêt du traitement.
En médecine vétérinaire, le métronidazole a été utilisé pour le traitement des chats et des chevaux. La vancomycine a été utilisée chez le cobaye et chez des hamsters de laboratoire afin d'enrayer des cas de mortalité chez des animaux utilisés dans des expérimentations de longue durée. La bacitracine a parfois été recommandée pour le traitement des chevaux et elle est utilisée pour le traitement des porcs même si deux études, effectuées sur des souches isolées du cheval, montrent que Clostridium difficile résiste à la bacitracine. Selon Yaeger (2002), l'érythromycine, la tiamuline et la tylosine pourraient être efficaces pour le traitement des porcelets.
Les principales mesures prophylactiques consistent à utiliser les antibiotiques de manière rationnelle (et donc modérée), à prescrire, chaque fois que c'est possible, des antibiotiques à spectre étroit et à éviter les associations d'antibiotiques. Chez l'homme, l'utilisation de Saccharomyces boulardii (UltralevureR) a fait la preuve de son efficacité dans la prévention des colites pseudo-membraneuses, des diarrhées post-antibiotiques et dans la prévention des rechutes.
Ces mesures doivent être complétées par des mesures d'hygiène : port de gants à usage unique par le personnel manipulant des fèces ou des objets souillés, lavage soigneux des mains avant et après les soins, utilisation de thermomètres jetables, nettoyage et désinfection (désinfectants à base d'hypochlorite ou de glutaraldéhyde à 2 p. cent) des locaux et du matériel...
De plus, chez l'homme, on considère que toute diarrhée observée chez un individu hospitalisé doit faire l'objet d'un examen bactériologique et un patient infecté par Clostridium difficile doit être placé dans une chambre particulière bénéficiant de toilettes individuelles.
Ces mesures de prophylaxie sanitaire ont pour but d'éviter la contamination du milieu extérieur et des individus (homme ou animaux) hospitalisés souvent sous antibiothérapie et/ou affaiblis. En revanche, tant qu'ils ne reçoivent pas d'antibiotiques, les médecins, les vétérinaires et, d'une manière générale, le personnel soignant, dotés d'une flore intestinale normale, sont à l'abri des risques de contagion.
L'administration d'immunoglobulines colostrales de bovins, immunisés avec un filtrat de culture de Clostridium difficile, s'est montrée efficace dans un modèle expérimental (hamsters traités à la clindamycine et expérimentalement infectés). Des essais de vaccination, utilisant des souches atténuées de Vibrio cholerae ayant reçu un plasmide codant pour l'extrémité COOH terminale de la toxine A, ont permis d'obtenir la synthèse d'anticorps spécifiques chez le lapin. En médecine vétérinaire, des autovaccins sont couramment utilisés dans les élevages porcins.
La base de données PubMed (interrogation effectuée le 20 février 2002) recense plus de 3000 documents traitant de Clostridium difficile. Aussi, à l'exception des articles consacrés aux infections des animaux, la majorité des publications citées ci-dessous correspond à des articles de synthèse.
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* : Milieu CCFA (Cycloserine Cefoxitin Fructose Agar), composition pour 1 litre
Formulation originale
Protéose peptone N° 2 : 40,0 g
Agar : 25,0 g
Fructose : 6,0 g
Na2HPO4 : 5,0 g
NaCl : 2,0 g
KH2PO4 : 1,0 g
MgSO4 7H20 : 0,1 g
Emulsion de jaune d'œufs (11 jaunes d'œufs + 1 œuf entier) : 10,0 mL
Solution d'antibiotiques (0,5 g de cyclosérine et 0,016 g de céfoxitine dans 10 mL d'eau distillée) : 10 mL
Solution de rouge neutre (0,1 g de rouge neutre, 10,0 mL d'éthanol) : 3,0 mL
Solution d'hémine (0,5 g d'hémine, 10,0 mL de soude normale, 90,0 mL d'eau distillée) : 1,0 mL
Autres formulations
La céfoxitine peut être remplacée par 0,004 g de céfotaxime ce qui augmente la sensibilité et la spécificité du milieu.
Le jaune d'œuf peut être remplacé par du sang de cheval (10 p. cent).
Les concentrations en cyclosérine et en céfoxitine peuvent être réduites de moitié.