J.P. Euzéby : Dictionnaire de Bactériologie Vétérinaire |
Dernière mise à jour le 11 juin 2000
MYCOBACTERIUM GENAVENSE
Systématique
La nomenclature de "Mycobacterium genavense" a été proposée en 1992 pour des souches de mycobactéries isolées de patients infectés par le virus HIV et présentant de la fièvre, de la diarrhée et une perte de poids importante. L'examen de biopsies et de prélèvements d'autopsie permettait de mettre en évidence de nombreux bacilles acido-alcoolo-résistants dans divers tissus dont le foie, la rate, l'intestin et les nœuds lymphatiques. En 1993, cette bactérie a été isolée d'oiseaux d'ornement et, depuis cette date, elle a été mise en évidence à plusieurs reprises dans des prélèvements d'origine animale.
L'étude de la séquence des ADNr 16S montrait que cette mycobactérie constituait une nouvelle espèce apparentée à Mycobacterium simiae. Cependant, l'absence de culture sur les milieux solides et la faible croissance observée en milieux liquides ne permettaient pas une étude phénotypique. En l'absence de caractères phénotypiques, il était impossible de décrire cette nouvelle espèce et son nom devait être écrit entre guillemets : "Mycobacterium genavense".
Ultérieurement, la culture a pu être obtenue sur gélose de Middlebrook 7H11 enrichie en mycobactine J ce qui a permis à Böttger et al. (1993) de réaliser quelques tests phénotypiques (tests biochimiques, sensibilité aux antibiotiques, analyse des acides gras et analyse des acides mycoliques). Les caractères phénotypiques permettent de caractériser cette nouvelle espèce et les auteurs publient de manière valide la nomenclature de Mycobacterium genavense.
Caractères bactériologiques
Outre les caractères communs à la famille des Mycobacteriaceae* et au genre Mycobacterium**, les souches de Mycobacterium genavense présentent les caractères suivants :
Dans les lésions ou dans les cultures effectuées en milieu liquide, les bactéries se présentent sous la forme de cocco-bacilles acido-alcoolo-résistants, de 1,0 mm de diamètre sur 2,0 mm de longueur, groupés en amas. Après culture en milieux solides, les bactéries sont polymorphes et leur longueur peut atteindre 6 µm. Le profil des acides gras est semblable à celui de Mycobacterium fortuitum et les acides mycoliques ont une structure proche de celle de Mycobacterium malmoense et de Mycobacterium simiae.
Le type respiratoire est aérobie mais la croissance est stimulée par une incubation dans une atmosphère micro-aérophile.
Compte tenu de la faible croissance du germe in vitro, les caractères biochimiques sont difficiles à étudier et les caractères négatifs doivent être interprétés avec prudence. Une réponse positive est obtenue pour la présence d’une catalase thermostable, d’une pyrazinamidase et d’une uréase. Une réponse négative est notée pour les tests niacine, nitrate réductase, hydrolyse du Tween et présence d’une arylsulfatase. La très grande majorité des souches est sensible à la p-nitro-alpha-acétylamino-bêta-hydroxypropiophénone.
La culture est toujours lente et difficile. Lors des premières études effectuées sur Mycobacterium genavense, la culture n'avait été obtenue que dans des milieux liquides (système radiométrique BACTEC) après 3 à 12 semaines d'incubation. Ultérieurement, une croissance en milieu solide a été obtenue par repiquage des milieux liquides sur milieu de Middlebrook 7H11 additionné de mycobactine J (colonies visibles après 3 à 9 semaines d'incubation) ou sur milieu de Middlebrook 7H9 additionné de charbon et d'extraits de levure (colonies visibles après un temps d'incubation compris entre 6 semaines et 9 mois).
Après 3 à 9 semaines d’incubation sur milieu 7H11 enrichi en mycobactine J, les colonies sont petites, transparentes, dysgoniques et non photochromogènes. En prolongeant l’incubation, on peut voir apparaître des colonies eugoniques qui sont soit denses et d’aspect crémeux soit plates et sèches.
Toutes les souches cultivent à 31, 37 ou 42 °C, aucune souche ne se développe à 45 °C et quelques souches cultivent faiblement à 24 °C.
La recherche des conditions optimales de culture a fait l'objet de plusieurs publications dont les principaux résultats sont les suivants :
. La croissance n'est pas observée ou rarement observée sur les milieux d'usage courant en mycobactériologie : Coletsos, Ogawa, Löwenstein-Jensen, Herrold, Middlebrook 7H10, Middlebrook 7H11…
. La croissance est toujours plus rapide dans les milieux liquides (système BACTEC) que sur les milieux solides.
. La présence dans les milieux liquides (système BACTEC) de stéarate de polyoxyéthylène ou de PANTA (50 U/mL de polymyxine B, 5 µg/mL d'amphotéricine B, 20 µg/mL d'acide nalidixique, 5 µg/mL de triméthoprime et 5 µg/mL d'azlocilline) a un effet inhibiteur sur la croissance.
. Le pH des milieux joue un rôle important et la croissance est optimale pour des pH compris entre 5,5 et 6,4.
. L'addition de mycobactine J, de sang, de charbon ou d'extraits pancréatiques de caséine favorise la croissance.
. La mycobactine n'est pas indispensable mais elle permet une croissance plus rapide. La mycobactine n'agirait pas en tant que chélateur de fer mais en tant que chélateur de divers ions métalliques toxiques pour Mycobacterium genavense.
. Les effets bénéfiques du sang et du charbon sur la croissance sont liés à une destruction ou à une neutralisation de l'eau oxygénée ce qui prévient l'accumulation de dérivés oxygénés toxiques. Mycobacterium genavense est une bactérie micro-aérophile préférentielle et la présence de sang et/ou de charbon lui permettent de croître plus facilement en aérobiose.
. La décontamination des prélèvements a un effet néfaste sur la viabilité du germe.
. Une étude comparative (Realini et al. 1999) des performances de 10 milieux de culture solide à base de milieux de Middlebrook 7H9, 7H10 ou 7H11 contenant différents additifs (charbon, sang de mouton, extraits de levure ou mycobactine J) et acidifiés ou non par de l'acide phosphorique montre que toutes les souches sont capables de croître, en un mois, sur trois milieux solides : 1) sur un milieu de Middlebrook 7H9 à pH 6,2 ± 0,2 additionné de charbon et d'extraits de levure ; 2) sur un milieu de Middlebrook 7H11 à pH 6,2 ± 0,2 additionné de sang de mouton et 3) sur un milieu de Middlebrook 7H11 à pH 6,2 ± 0,2 additionné de sang de mouton et de charbon. Les milieux peuvent être incubés en atmosphère normale à 37 °C et la croissance est obtenue dans un délai compris entre 4 et 12 semaines selon la richesse bactérienne de l'inoculum.
Le milieu donnant les meilleurs résultats (nombre de cultures positives et vitesse d'apparition des colonies) est le milieu de Middlebrook 7H11 (Difco) contenant 0,2 p. cent de charbon (Sigma), 10 p. cent de sang de mouton défibriné (Ego Laboratories) et dont le pH est ajusté à 6,2 ± 0,2 avec de l'acide phosphorique (Merck). De plus, il semble permettre la croissance des bactéries présentes dans des prélèvements décontaminés.
Mycobacterium genavense se différencie des autres mycobactéries à croissance lente par ses caractères culturaux (croissance plus facile en milieux liquides et absence fréquente de croissance sur les milieux solides couramment utilisés pour les mycobactéries) et par quelques caractères mentionnés dans le tableau I.
Habitat et pouvoir pathogène
En raison de la difficulté d'obtention des cultures, le nombre de souches isolées est encore faible et les données concernant l'habitat de Mycobacterium genavense sont peu nombreuses. Il en va de même pour les données permettant d'apprécier l'importance réelle des infections dans la pathologie de l'homme ou des animaux.
Mycobacterium genavense semble avoir une répartition géographique vaste et cette espèce a été isolée en Australie, en Amérique du Nord et en Europe. Son habitat est inconnu et aucune souche n'a été isolée de l'environnement. Toutefois on considère que l'habitat pourrait être le milieu extérieur. A l'appui de cette hypothèse, on peut noter que Mycobacterium genavense a été identifié par PCR dans l'eau du robinet d'un hôpital d'Amsterdam et que l'eau contaminée a été à l'origine de trois cas d'infection observés chez des individus infectés par le virus HIV.
La voie de contamination, aussi bien chez l'homme que chez l'animal, semble être la voie orale. Il en résulterait une infection intestinale qui pourrait être le point de départ d'infections généralisées.
Chez l'homme, Mycobacterium genavense est responsable d'infections disséminées chez des adultes ou des enfants présentant des troubles importants du système immunitaire (individus atteints de SIDA et, moins fréquemment, individus suivant un traitement immunodépresseur). Un cas d'infection des tissus mous a également été décrit chez une femme immunodéprimée. Chez des sujets immunocompétents quelques cas d'adénites cervicales ont été observés.
Les infections à Mycobacterium genavense ont été décrites à plusieurs reprises chez des oiseaux d'ornements, notamment chez des Coraciiformes, des Galliformes, des Passeriformes, des Piciformes et des Psittaciformes. Chez les oiseaux d'ornement, Mycobacterium genavense semble être la mycobactérie la plus fréquemment responsable d'infections. En effet, dans une étude portant sur 204 animaux atteints de mycobactériose, les auteurs ont pu caractériser 48 souches de mycobactéries dont 34 souches de Mycobacterium genavense, 8 souches de Mycobacterium avium, 2 souches de Mycobacterium fortuitum, 2 souches de Mycobacterium tuberculosis, 1 souche de Mycobacterium gordonae et 1 souche de Mycobacterium nonchromogenicum.
L'infection se traduit généralement par une mort brutale parfois précédée d'un amaigrissement ou d'épisodes diarrhéiques. Les lésions macroscopiques sont modestes mais on note parfois une splénomégalie, une hépatomégalie et une congestion de l'intestin et des poumons. L'examen histologique révèle la présence inconstante de nodules non caséeux, contenant des macrophages de grande taille et siégeant dans le foie, la rate, les poumons et les reins. Une coloration à l'auramine ou une coloration de Ziehl, effectuée sur des frottis d'organes, met en évidence des bactéries acido-alcoolo-résistantes souvent en nombre important.
Les infections aviaires à Mycobacterium genavense se distinguent des infections à Mycobacterium avium qui ont une durée d'évolution généralement plus longue (la mort intervient souvent entre 2 et 6 mois après l'apparition des signes cliniques) et qui se caractérisent par la présence de nodules grisâtres ou blanchâtres, de taille variable, siégeant sur le foie et la rate.
Un cas d'infection a été décrit chez un chien vivant à New York et présentant des difficultés de locomotion. L'examen clinique a révélé une raideur des membres postérieurs, une douleur à la palpation des membres, une adénite des nœuds lymphatiques superficiels et une hyperthermie (39,4 °C). Des examens complémentaires ont mis en évidence une hépatomégalie et une splénomégalie. L'examen d'une biopsie d'un nœud lymphatique a permis de visualiser de nombreuses bactéries acido-alcoolo-résistantes localisées dans les histiocytes. La culture a été effectuée par la méthode radiométrique BACTEC et l'identification a été assurée par amplification et séquençage de l'ADNr 16S.
Aucun cas de contamination de l'homme n'a été attribué à un contact avec un animal infecté mais on ne peut exclure une telle éventualité. Aussi, il semble souhaitable d'informer les propriétaires de ce risque potentiel notamment s'ils présentent une immunodépression sévère.
Expérimentalement, l'injection par voie intraveineuse à des souris provoque une infection chronique disséminée mais, non létale. Le foie et la rate se révèlent les organes les plus infectés. Les mécanismes immunitaires de résistance sont similaires à ceux mis en jeu vis-à-vis d'autres mycobactéries car ils reposent sur les lymphocytes T : infections plus sévères chez la souris nude athymique, infections plus sévères chez les souris normales traitées par des anticorps monoclonaux anti-CD8, anti-CD4 ou anti-interféron gamma. Le rôle des lymphocytes T dans la résistance acquise explique la susceptibilité des patients atteints de SIDA
Diagnostic bactériologique des infections aviaires
Chez les oiseaux, l'infection doit être suspectée dans les circonstances suivantes : mort rapide non précédée de signes cliniques importants ; absence de lésions macroscopiques ou présence de lésions macroscopiques modestes ; présence de bacilles acido-alcoolo-résistants dans des calques ou des frottis d'organes ; absence de culture sur les milieux classiquement utilisés en mycobactériologie.
L'utilisation du système BACTEC (de préférence milieu "BACTEC PZA Test Medium" dont le pH est acide), à condition de conserver les milieux au moins 8 semaines, permet souvent de cultiver Mycobacterium genavense. L'identification repose ensuite sur l'amplification et le séquençage de l'ADNr 16S.
Les techniques de biologie moléculaire (PCR et séquençage) peuvent également être mises en œuvre sur l'ADN extrait des prélèvements.
Chevrier et al. (1999) ont identifié un fragment d'ADN de 1734 paires de bases spécifique de Mycobacterium genavense. L'utilisation d'amorces et de sondes non radioactives spécifiques permet de caractériser un fragment de 155 paires de bases chez les 13 souches étudiées. La technique semble spécifique car une réaction négative est obtenue avec 20 autres espèces de mycobactéries y compris avec Mycobacterium simiae qui est étroitement apparenté à Mycobacterium genavense. Selon les auteurs la technique est simple à mettre en œuvre, elle est facilement automatisable et elle permet, en une étape, de différencier Mycobacterium genavense des autres mycobactéries. Medenhall et al. 2000) ont également décrit un test PCR, basé sur l'amplification d'un fragment du gène hsp65 et sur l'analyse des fragments de restriction des amplicons obtenus. Ce test permet de différencier des cultures de Mycobacterium genavense des cultures de Mycobacterium avium et il pourrait être utilisable directement sur des prélèvements.
Le système BACTEC et les techniques de biologie moléculaires ne sont pas accessibles à tous les laboratoires de bactériologie vétérinaire aussi, l'utilisation d'un milieu de Middlebrook 7H11 acidifié et additionné de charbon et de sang de mouton, tel qu'il est préconisé par Realini et al. (voir le paragraphe consacré aux caractères bactériologiques), semble être une alternative.
La technique utilisée par Realini et al. consiste à découper le prélèvement, à le broyer au mortier puis à le centrifuger à 10 °C durant 15 minutes à 100 g afin d'éliminer les débris tissulaires. Le surnageant est ensuite centrifugé à 10 °C durant 45 minutes à 2700 g. Le culot de centrifugation est repris dans du PBS et la suspension bactérienne est ensemencée à raison de 0,2 mL sur le milieu coulé en pente dans des tubes bouchés au silicone. Les tubes sont incubés à 37 °C dans une atmosphère normale, une nuit en position horizontale puis durant trois mois en position verticale. La culture est généralement obtenue en 4 à 12 semaines en fonction de la richesse de l'inoculum (4 semaines pour un inoculum contenant 107 bactéries/mL, 12 semaines pour un inoculum contenant 102 bactéries/mL) et, expérimentalement, le nombre de colonies est très proche du nombre de bactéries inoculées.
Le milieu de Middlebrook 7H11 acidifié et additionné de charbon et de sang de mouton semble permettre la croissance de Mycobacterium genavense présent dans un prélèvement décontaminé. En effet, un prélèvement d'origine aviaire (9,6 X 106 bactéries/mL), ayant subi une décontamination, a donné un résultat positif en 2 mois. La culture est confluante lorsque la décontamination est effectuée à l'aide de N-acétyl-L-cystéine ou d'acide chlorydrique 1N ultérieurement neutralisé à la soude. Le nombre de colonies est compris entre 200 et 500 après une décontamination au dodécyl sulfate de sodium et compris entre 100 et 200 après décontamination selon la technique de Petroff (technique à la soude).
Les résultats de Realini et al. doivent être considérés comme provisoires mais leur technique est à la portée de tous les laboratoires qui peuvent facilement ensemencer un prélèvement (sans décontamination et après décontamination à la N-acétyl-L-cystéine ou à l'acide chlorydrique) d'une part sur milieu de Middlebrook 7H11 acidifié et additionné de charbon et de sang de mouton et d'autre part sur un milieu classique comme le milieu de Löwenstein-Jensen. L'obtention d'une culture sur le milieu 7H11 et l'absence de culture sur le milieu de Löwenstein-Jensen ne donnent pas une certitude mais orientent fortement le diagnostic vers Mycobacterium genavense.
Sensibilité aux antibiotiques
Les données concernant la sensibilité aux antibiotiques sont encore fragmentaires et il est difficile de déterminer le spectre de sensibilité car la bactérie cultive lentement et la culture nécessite un pH acide de l'ordre de 6. Ce pH acide a pour conséquence de diminuer l'activité de certains antibiotiques comme l'éthambutol, la clarithromycine ou la clofazimine.
Une sensibilité est notée vis-à-vis de la streptomycine, de la rifampicine, de la rifabutine, de la roxithromycine, de la clarithromycine, de l'azithromycine et de l'acide fusidique.
Une sensibilité variable selon les souches est observée pour l'amikacine, la ciprofloxacine, l'ofloxacine, l'éthambutol et les souches résistent à l'isoniazide.
Orientation bibliographique
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* La famille des Mycobacteriaceae
La famille des Mycobacteriaceae constitue avec les familles des Corynebacteriaceae (genres Corynebacterium et Turicella), des Dietziaceae (genre Dietzia) des Gordoniaceae (genre Gordonia) des Nocardiaceae (genres ¤ Nocardia et ¤ Rhodococcus) et des Tsukamurellaceae (genres Tsukamurella), le sous-ordre des Corynebacterineae placé dans l'ordre des Actinomycetales (voir le fichier ¤ Actinobacteria). Elle est constituée d'un unique genre, le genre Mycobacterium qui compte, à la date du 13 mars 2000, 85 espèces dont deux (Mycobacterium avium et ¤ Mycobacterium fortuitum) sont divisées en sous-espèces (voir : ¤ Mycobacterium in ¤ List of Procaryotic Names with Standing in Nomenclature).
La définition de la famille des Mycobacteriaceae et de son unique genre repose sur trois critères : l'acido-alcoolo-résistance, la composition des acides mycoliques et la valeur du G + C. p. cent.
. Acido-alcoolo-résistance
Les mycobactéries, après avoir été colorées à chaud par la fuchsine phéniquée de Ziehl ou à froid par la fuchsine phéniquée de Kinyoun ou à froid par l'auramine, retiennent les colorants même après avoir été traitées par l'action successive ou simultanée d'acide et d'alcool. Cette propriété tinctoriale repose sur la présence d'acides mycoliques (Cf. infra).
Les espèces des genres Corynebacterium, Dietzia, Gordonia, ¤ Nocardia, ¤ Rhodococcus et Tsukamurella peuvent présenter un caractère d'acido-résistance, notamment lorsqu'elles sont cultivées dans des milieux riches en lipide mais elles sont décolorées par l'action conjointe d'acide et d'alcool.
. Composition des acides mycoliques
Les acides mycoliques sont des acides gras à longue chaîne carbonée, alpha-ramifiés et bêta-hydroxylés. Ils sont des constituants majeurs de la paroi et ils sont liés au peptidoglycane par l'intermédiaire d'arabinogalactane. Ils constituent une barrière hydrophobe autour de la bactérie, prévenant l'action décolorante des acides et des alcools et ils confèrent à la bactérie une résistance à des agents chimiques ce qui est mis à profit pour l'isolement de ces germes dans un prélèvement plurimicrobien (méthodes de décontamination).
Les espèces des genres Corynebacterium, Dietzia, Gordonia, ¤ Nocardia, ¤ Rhodococcus et Tsukamurella synthétisent également des acides mycoliques. La structure des acides mycoliques diffère selon les genres et cette propriété est mise à profit en taxonomie. Contrairement aux acides mycoliques des autres genres, ceux des mycobactéries sont des molécules de haut poids moléculaire, contenant entre 60 et 90 atomes de carbone et qui, après pyrolyse, libèrent des esters comprenant 22 à 26 atomes de carbone. De plus, seules certaines espèces du genre Mycobacterium synthétisent des acides mycoliques porteurs de fonctions oxygénées supplémentaires (méthoxyl, cétone, époxyde, carboxylique).
. G + C p. cent
À l'exception de Mycobacterium leprae (G + C p. cent compris entre 54 et 57), toutes les mycobactéries ont un G + C p. cent variant de 61 à 71.
** Caractères bactériologiques du genre Mycobacterium
Les mycobactéries sont des bacilles droits ou légèrement incurvés, de 0,2 à 0,6mm de diamètre sur 1,0 à 10,0 mm de longueur, présentant parfois des renflements ou des ramifications, formant occasionnellement des hyphes rampants qui se fragmentent très facilement en éléments bacillaires (Mycobacterium farcinogenes et Mycobacterium senegalense donnent des filaments qui se fragmentent peu), ne formant jamais d’hyphes aériens visibles à l'œil nu, prenant difficilement la coloration de Gram mais considérés comme à Gram positif (en fait, la paroi des mycobactéries possède une structure plus complexe que la paroi des bactéries à Gram positif et, sur un frottis coloré par la technique de Gram, les mycobactéries apparaissent souvent comme non colorées, sous la forme de "fantômes" ce qui les fait qualifier parfois de "à Gram neutre"), acido-alcoolo-résistants (coloration de Ziehl-Neelsen, coloration de Kinyoun, coloration fluorescente à l’auramine phéniquée), immobiles, non sporulés, aérobies stricts, catalase positive.
Sur le plan structural, elles se caractérisent par une paroi originale, très riche en lipides (60 p. cent des constituants) et dont la constitution explique, au moins partiellement, les propriétés tinctoriales, la pathogénicité et la résistance à divers antibiotiques.
La paroi est constituée de 3 couches. La plus interne, qualifiée de squelette pariétal, est formée d’un peptidoglycane sur lequel est fixé un polymère d’arabino-galactane composé de l’alternance de molécules d’arabinose et de galactose qui s’attachent par des liaisons esters à des acides mycoliques situés dans la couche intermédiaire (apparaissant comme un espace clair en microscopie électronique). La partie externe de la paroi, est formée d’une matrice de phospholipides (phospholipides simples estérifiés par des acides tuberculostéariques et phospholipides contenant du mannose), de molécules amphiphiles (sulpholipides, phénolglycolipides, dimycolates de tréhalose...), de protéines dont certaines sont sans doute des porines et de mycosides. Les mycosides sont des peptidoglycolipides dont la structure antigénique permet, pour certaines espèces, de décrire des sérovars. Chez certaines souches, la couche externe de mycosides peut être très épaisse et forme une pseudocapsule. La paroi est traversée de part en part par des molécules de lipo-arabinomananne qui sont ancrées par leur partie lipidique dans la membrane cytoplasmique et dont la partie polysaccharidique gagne la surface cellulaire. Ces molécules joueraient un rôle dans la cohésion de la paroi.
Selon les espèces, le temps de génération des mycobactéries varie de 2 heures à plus de 200 heures et les colonies ne sont visibles qu’après un temps d'incubation compris entre 2 jours et 10 semaines, voire plus. En fonction de leur vitesse de croissance, les espèces du genre Mycobacterium sont divisées en 2 groupes :
. les mycobactéries à croissance lente, ne formant des colonies qu'après 7 jours de culture et incapables de cultiver sur des milieux bactériologiques standards.
. les mycobactéries à croissance rapide, formant des colonies en moins de 7 jours et aptes à se développer sur gélose nutritive ou peptonée.
Les mycobactéries à croissance lente possède une seule copie des gènes codant pour les ARNr alors que celles à croissance rapide en possèdent au moins deux.
Les colonies sont lisses (S) ou rugueuses (R), eugoniques (de taille importante) ou dysgoniques (colonies minuscules), non pigmentées ou produisant des pigments caroténoïdes non diffusibles. Dans ce dernier cas, on distingue les espèces photochromogènes (pigmentation apparaissant lorsque la culture est réalisée à la lumière) et les espèces scotochromogènes (pigmentation également visible après culture à l’obscurité). Certaines espèces n’ont jamais pu être cultivées in vitro (Mycobacterium leprae) ou ne sont cultivables que très difficilement (Mycobacterium genavense, ¤ Mycobacterium lepraemurium).